摘要
为临床能快速诊断虎源流感,通过对本室分离获得的4株虎源流感病毒的HA和NA基因序列分析,结合GenBank中报道的A型流感病毒HA、NA、NP序列,选择保守序列区作为扩增区域.利用Primer5.0软件设计出各个基因的特异性引物,扩增片段大小分别为581bp、173bp、464bp.首先建立三个基因各自的单项RT-PCR检测方法,并用琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和PCR产物回收纯化后DNA序列测定鉴定扩增产物,同时对其敏感性、特异性进行检测.结果,三对引物特异性良好,敏感性试验证明其检出的最少病毒量约100个TCID<,50>.设计一对用于cDNA合成的A型流感病毒通用反转录引物,在此基础上,通过优化反应体系及条件,建立一步法可同时扩增出3个基因的联合RT-PCR方法,敏感性检测与单项RT-PCR方法无明显差别.将该方法用于16份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法进行比较.结果显示,所建立方法的检出率和病毒分离结果相符,高于电镜负染和HA/HI试验.
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