摘要
家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4(EA4)的倒计时型生物钟.EA4是具时间间隔测定酶(Time Interval Measuring Enzyme,TIME)功能的蛋白质.根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以3d龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT-PCR方法,得到308bp的部分ea4序列,其1-144nt和145-308nt分别与家蚕2个WGS(AADK01019126.1) 5595-5738nt和WGS(AADK01014467.1)的8636-8473nt有95％和98％的一致性,翻译蛋白质的氨基酸序列与EA4测定的氨基酸序列对应部分一致性为98％.根据获得的ea4基因片段序列,利用生物信息学方法和家蚕基因组数据预测了ea4基因的完整cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,RT-PCR得到完整的cDNA.ea4基因的cDNA全长519bp,其中1-48bp为信号肽序列,49-519bp编码的氨基酸与蛋白质纯化后测序的EA4部分一致性98％,存在C末端3个氨基酸的差异,其中第156位为新确定氨基酸.
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