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猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其免疫原性与抗体检测ELISA方法研究

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支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎.更重要的是,该菌的先期感染易于导致其它多种病原的继发感染,加重病情造成较严重损失.百日咳杆菌黏附素是由Bbprn基因编码的一种重要的黏附因子,被认为是Bb最主要的保护性抗原. 本研究克隆了猪源Bb强毒株HH0809的prn基因,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统在大肠杆菌中进行了融合表达。克隆基因的核苷酸和氨基酸序列与GeneBank已经提交的所有猪源Bb的prn序列均具有98％以上的同源性。利用ProtParam软件对融合表达蛋白的理化性质进行预测分析,结果显示不稳定系数为38.33,属于稳定型蛋白质.SDS-PAGE和Western blot检测证实该基因获得高效表达并具有良好的免疫学活性。经GST融合蛋白纯化试剂Glutathione SepharoseTM 4B纯化后,得到浓度为207.3μg/mL、纯度为90.1％的融合蛋白GST-PRN.在小鼠免疫保护力试验中,重组蛋白免疫组BalB/C小鼠能够抵抗3.2×LD50量的Bb强毒株HH0809的呼吸道气雾攻击,保护率为100％(20/20),而GST载体蛋白对照组和PBS空白对照组的小鼠分别存活了4只和3只.这证明原核表达的PRN蛋白具有天然PRN外膜蛋白的免疫效力,可考虑作为新型疫苗或疫苗添加成分.通过凝血酶Thrombin酶切融合表达产物GST-PRN并回收,获得纯度为93.1％、浓度为120.5 μg/mL的不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段。以PRN蛋白片段为抗原建立检测百日咳杆菌黏附素抗体的间接ELISA方法。方阵滴定结果显示,血清最佳稀释度为1:40,PRN抗原最佳稀释度为1:320(43.9 μg/孔)。阴阳性临界点。为0.335.重复实验中变异系数最大为7.83％,最小为3.51％。猪巴氏杆菌病、猪大肠杆菌病、仔猪副伤寒、猪传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪气喘病阳性血清和5份猪波氏菌病阴性血清用ELISA检测都呈阴性。ELISA方法对2份接种了猪波氏菌病灭活菌苗的猪血清和2份Bb感染猪血清的检测结果均为阳性。敏感性试验表明,该ELISA方法的敏感性比本实验室已经建立的乳胶凝集试验方法高4～128倍；该ELISA方法能够检测到人工感染Bb仔猪14 d的血清抗体IgG.该ELISA方法对临床送检的1229份猪血清的检测阳性率为32.7％。同时,该方法对湖北2个阳性猪场各年龄段猪群的临床监测结果表明,生长前期(36～55日龄)和育肥期(56～90日龄)猪群的阳性率明显高于断奶前(15～21日龄)和保育期(22～35日龄)猪群. 本研究建立的PRN抗体监测ELISA方法具有较好的重复性、特异性和敏感性,有望成为一种准确、快速和实用的猪波氏菌病血清学诊断方法。

赵战勤、薛云、吴斌、汤细彪、何华、胡睿铭、张建民、陈焕春

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华中农业大学动物医学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070

猪波氏菌病 支气管败血波氏杆菌 百日咳杆菌 黏附素 免疫原性 ELISA法 原核表达 抗体检测

中国畜牧兽医学会

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

2007-09-20

江西井冈山

中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会

481-487

2007