摘要
鳞翅目昆虫模式昆虫家蚕滞育卵内酯酶A4 (EA4)的瞬时ATPase活性具有滞育生物钟的作用。我们用基因克隆、RACE (Rapid Amplification of cDNA End, RACE)和序列拼接等方法,研究了ea4的全基因结构;用核酸杂交和RT-PCR半定量方法研究了ea4在家蚕体内的时空表达谱和调控方式。家蚕ea4基因cDNA全长605bp,ORF为519bp,编码长172个氨基酸的蛋白质,其中前16个氨基酸为信号肽。ea4基因全长10266bp,有4个外显子(23bp、69bp、204bp和309bp)和3个内含子(4890bp、3521bp和1250bp)。家蚕EA4蛋白质具有SOD和酯酶双重酶活性,与已知的家蚕酯酶和SOD的同源性很低,与NCBI登陆的各种模式生物的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的同源性极低,也没有酯酶的核心结构域(FGGdpelItLfGeSAG);相反EA4与牛等的Cu/Zn-SOD氨基酸的同源性较高,而且具有Cu/Zn-SOD的核心结构域(GFHVHEKGDLS和GNAGGRVACGVI)。推测家蚕EA4可能是起源于Cu/Zn-SOD家族的一种新型的特异酯酶。核酸杂交和半定量PCR分析表明,家蚕ea4基因没有性别、组织、发育时期表达特异性,也不被低温和盐酸等滞育蚕卵活化方法而激活基因表达活性。从基因转录调控水平证明家蚕EA4对环境低温、盐酸等活化刺激的时间间隔测定酶作用,不是反馈环境刺激激活基因表达的调控方式,而是依靠蛋白空间结构变化测时。
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