摘要
目的：构建不同高拷贝数重组表达质粒并转入酵母，以比较研究人凝血因子Ⅶ(FⅦ)蛋白在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达时，表达单元拷贝数与表达量之间的关系。 方法：通过对单拷贝表达质粒进行改造，将表达单元(5'-AOX-FⅦ-TT-3')重复导入载体，构建2-5个表达单元串联的高拷贝重组菌体，探讨表达单元拷贝数与表达量之间的关系。并进行了15L发酵中试培养，比较不同拷贝数酵母在发酵罐培养中的表达情况。 结果：构建获得pPIC9K/FⅦ表达单元串联的2-5个不同拷贝数的高拷贝重组酵母。摇瓶表达显示，随着拷贝数的增加，FⅦ表达量呈抛物线状增加。在15L发酵罐中，5个拷贝数的重组体不如单拷贝重组体生长旺盛，并发生了溶菌现象。发酵产物经超滤脱盐浓缩后的活性测定表明表达的重组FⅦ有生物活性，并且活性随蛋白浓度增高而呈递增趋势。 结论：构建含高拷贝数表达质粒的工程菌可提高毕赤酵母FⅦ表达量，此为获取低成本有活性的重组FⅦ提供了一条新的途径。
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