骨骼肌是动物机体最大的运动器官,骨骼肌的发育对动物机体的健康至关重要.脯氨酸羟化酶(PHDs)是缺氧诱导因子信号通路的经典调节因子,许多研究者发现,PHDs参与了肌纤维类型的转换、肌肉再生和心肌细胞分化等生理进程.然而,PHDs是否能影响动物骨骼肌蛋白质周转过程,目前尚不清楚.本研究采用C57BL/6J小鼠为研究模型,通过坐骨神经剥离手术,构建了去神经肌肉萎缩小鼠模型,发现PHD3在萎缩侧肌肉中高度表达,且PHD3的表达水平与骨骼肌重量有显著负相关性(P＜0.05),而PHD1和PHD2的表达水平则没有这种趋势.此外,在正常小鼠不同重量肌肉中,也得到了相似结果.为进一步验证PHD3与骨骼肌蛋白质周转的关系,通过将PHD3-sgRNA病毒注入MCK-Cre-Cas9小鼠胫骨前肌以及PHD3-shRNA慢病毒转染到肌肉卫星细胞中,建立PHD3干扰模型.结果表明,PHD3在骨骼肌中敲除可显著增加肌肉重量和肌纤维面积(P＜0.05).此外,蛋白质合成信号通路表达水平显著升高,而蛋白质降解途径则被明显抑制(P＜0.05).而在体外,5-炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)和四甲基罗丹明乙酯(TMRE)荧光检测结果表明,PHD3干扰可导致细胞增殖水平显著降低,细胞凋亡水平显著增加.卫星细胞分化后,干扰组细胞嘌呤霉素(Puromycin)的掺入量显著高于对照组,3-甲基组氨酸含量显著低于对照组(P＜0.05),与细胞内蛋白质周转信号通路的变化一致.在机制水平上,免疫共沉淀试验检测到PHD3、NF-κB和IKBα之间存在相互作用.干扰PHD3后,炎症信号通路的表达也显著降低(P＜0.05).这揭示PHD3可能通过介导炎症信号通路影响肌肉组织中蛋白质的周转.最后,在去神经肌肉萎缩小鼠和LPS诱导的肌管萎缩模型中敲除PHD3.结果表明,PHD3蛋白水平的降低可减轻小鼠去神经损伤所致的肌肉重量和肌纤维的减少.同时,去神经萎缩肌炎症信号通路蛋白水平和3-甲基组氨酸含量也显著降低(P＜0.05).细胞水平,PHD3敲除可减轻LPS诱导的肌管直径的降低,蛋白合成途径表达也显著增加(P＜0.05),另一方面,蛋白降解和炎症信号通路的表达水平明显降低(P＜0.05).通过这些系列研究,发现,去神经支配肌肉中PHD3的表达增加可能是诱导肌肉萎缩的重要调控因子,且这一过程可能是由炎症NF-κB信号通路介导的.
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