摘要
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)感染引起的一种急性烈性高度接触性传染病.CSF的爆发严重制约着养猪业的健康发展,被世界动物卫生组织定为A类传染病.目前,CSF在中南美洲和亚洲大部分国家仍然不断发生,且流行形式主要以散发为主,临床症状不典型.中国CSF也是以非典型为主,其毒株主要是基因Ⅰ群和基因Ⅱ群(1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群).由于猪群中长期使用猪瘟兔化弱毒疫苗C-strain(1.1基因亚群),CSFV流行毒株基因趋向逐渐远离疫苗株.虽然猪瘟兔化弱毒疫苗具有良好的免疫原性和安全性,在中国猪瘟预防和控制中发挥了重要的作用.但是随着猪瘟净化和根除的计划的实施,迫切需要一种标记疫苗来快速简便的区分疫苗免疫和野毒感染动物.另外猪瘟和猪圆环病毒2b(Porcine circovirus type2,PCV2b)都能导致母猪繁殖障碍,且PCV2Cap蛋白可以形成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),具有作为蛋白载体的潜在能力.因此,本研究利用杆状表达系统构建表达猪瘟病毒1.1E2和2.1E2蛋白的重组杆状病毒并研制新型的猪瘟基因工程亚单位疫苗,分别在兔和猪体上评价了其免疫效力研究.同时,以PCV2Cap为载体,在其N端连入CSFV的B细胞表位或T细胞表位,通过杆状病毒表达系统表达嵌合猪瘟表位的PCV2VLP疫苗,并对其免疫原性进行了评价.另外,在本实验室前期工作基础上构建了表达sIFITM3的转基因猪,并初步评价了其抗FMDV感染能力的研究.其具体研究内容如下:1.表达猪瘟1.1型和2.1型E2蛋白的亚单位疫苗的构建及免疫效力研究通过重叠PCR方法将锋素肽信号肽序列融合入1.1E2和2.1E2基因的N端,将获得的目的片段分别克隆入杆状病毒重组转移载体pFBD(本实验构建),获得携带3个拷贝外源基因的重组转移质粒pFBD-3-1.1E2和pFBD-3-2.1E2.进而转化入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选得到纯化的阳性菌落,提取杆粒后通过脂质体Cellfectin? Ⅱ Reagent转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-3-1.1E2和Ac-3-2.1E2.间接免疫荧光和Western blotting证实Ac-3-1.1E2和Ac-3-2.1E2在昆虫细胞中均能成功地表达1.1型E2和2.1型E2蛋白,并具有良好的免疫学活性.将40μg剂量的1.1型E2和2.1型E2蛋白分别与等体积的ISA206VG佐剂进行乳化制备成1.1E2、2.1E2和1.1+2.1E2亚单位疫苗.兔和猪的免疫原性试验结果表明,这三种亚单位疫苗在兔和猪体均能诱导产生很好的抗猪瘟病毒的ELISA抗体和中和抗体;同时都能诱导产生特异性的淋巴细胞增殖效应.尽管C-strain阳性免疫组的刺激指数略高于1.1E2、2.1E2和1.1+2.1E2免疫组,但差异不显著(P＞0.05).细胞因子的检测结果与淋巴细胞增殖一致,C-strain阳性免疫组的细胞免疫反应也高于其他免疫组,但与PBS阴性对照组相比,差异均显著(P＜0.05).兔体免疫效力试验结果表明,1.1E2和1.1+2.1E2免疫组兔在攻毒后表现为体温轻微升高,但无定型热现象;而2.1E2免疫组有2只兔出现定型热现象.本动物猪体的免疫效力试验结果显示:攻毒后2.1E2免疫组猪都出现体温升高现象,并且出现了典型的猪瘟临床症状,并在攻毒后几天内全部死亡;1.1E2和1.1+2.1E2免疫组有3头猪的体温升高,但都能保护猪抵抗猪瘟病毒强毒株的攻击,即诱导100％的保护性免疫反应.攻毒后不同时间血中猪瘟病毒的拷贝数的结果与临床表现一致.因此,本实验构建的重组杆状病毒表达的猪瘟病毒E2蛋白制备的1.1E2和1.1+2.1E2亚单位疫苗可以作为临床上预防猪瘟的疫苗候选株.2.表达猪瘟病毒表位的嵌合圆环VLPs疫苗的构建及免疫效力研究以PCV2b缺失Cap蛋白N端39个氨基酸核定位信号序列为骨架,在其N段插入猪瘟病毒的T细胞表位(1446-1460aa)及B细胞表位(693-716aa).同时根据Cap蛋白晶体结构,在其中间loop区插入猪瘟病毒的B细胞表位(693-716aa)进而构建猪瘟-猪圆环病毒病新型二联亚单位疫苗,为临床上共同防治猪瘟与猪圆环病毒病提供一个新型候选疫苗株.根据杆状病毒密码子偏爱性,对Cap-T、Cap-B、Cap-TB和Cap-1T2B基因进行密码子优化与合成,分别以合成的基因片段为模版进行PCR扩增,所获得的基因片段依次连入转移载体pFBD,得到4个不同的重组转移质粒pFBD-3-Cap-T、pFBD-3-Cap-B、pFBD-3-Cap-TB和pFBD-3-Cap-1T2B.根据杆状病毒表达系统操作说明书操作,获得4个重组杆状病毒Ac-3-Cap-T、Ac-3-Cap-B、Ac-3-Cap-TB和Ac-3-Cap-1T2B.通过间接免疫荧光和Western blotting试验证实这四株重组杆状病毒均能在昆虫细胞中高效表达外源基因,而且重组蛋白均定位于细胞核和细胞膜.在昆虫细胞中表达的目的蛋白Cap-T、Cap-B、Cap-TB和Cap-1T2B通过超高速离心纯化后经磷钨酸负染,电镜结果显示,Ac-3-Cap-T、Ac-3-Cap-B 和 Ac-3-Cap-TB 表达的外源蛋白(Cap-T、Cap-B 和 Cap-TB)均能组装形成与 PCV2病毒粒子相似的病毒样颗粒(VLPs),而Ac-3-Cap-1T2B表达的重组蛋白Cap-1T2B不能组装成病毒样颗粒.为了进一步研究表达猪瘟表位的嵌合圆环VLPs疫苗的免疫原性,分别在小鼠和兔体上评价这些嵌合猪瘟病毒T/B细胞表位的猪圆环病毒VLPs亚单位疫苗的免疫效果.动物试验结果表明,这4个嵌合猪圆环病毒VLPs疫苗,在小鼠和兔体后均能诱导机体产生针对猪圆环病毒2型的ELISA抗体和中和抗体,但Cap-1T2B免疫组的中和抗体水平低于其他免疫组,差异显著(P＜0.05),而Cap-T、Cap-B和Cap-TB免疫组之间差异不显著(P＞0.05).Cap-T、Cap-TB和Cap-1T2B免疫组还能诱导产生针对猪瘟病毒T细胞表位的IgG.Cap-B、Cap-TB和Cap-1T2B免疫组能产生针对猪瘟病毒B细胞表位的抗体IgG,但不能诱导机体产生猪瘟病毒的中和抗体.细胞免疫试验证实这4组疫苗均能诱导产生一定的淋巴细胞增殖反应,而且Cap-B免疫组诱导产生的IFN-水平最高,其次是Cap-T和Cap-TB免疫组,但这3组之间差异不显著(P＞0.05),IFN-平均含量为202.57pg/mL、227.33pg/mL 和192.79pg/mL;Cap-1T2B 免疫组的 IFN-水平比较低且是显著低于其他免疫组(P＜0.05).Cap-T和Cap-TB免疫组能诱导产生针对猪瘟病毒T细胞表位的特异性的CTL杀伤活性.其中Cap-T免疫组诱导CTL杀伤活性最高.兔体免疫效力试验显示,攻毒后嵌合猪圆环病毒VLPs各个免疫组和阴性对照组动物均表现为体温升高,呈现猪瘟定型热反应;所有兔体脾脏中均检测到CSFVRNA的存在.这些结果表明表达猪瘟病毒表位的嵌合猪圆环病毒VLPs疫苗在兔体上能产生很好的针对猪圆环病毒2型的免疫反应,但产生的针对猪瘟病毒表位的免疫反应不足以保护动物抵抗猪瘟病毒的攻击.3.过表达sIFITM3转基因猪的构建及抗FMDV的研究通过AccI酶切真核质粒psIFITM3,回收目的片段并转染猪成纤维细胞,获得表达sIFITM3的细胞系.通过手工克隆方法获得过表达sIFITM3蛋白的转基因猪.半定量检测显示sIFITM3基因在转基因组体内多个组织广泛分布.转基因猪与正常阴性对照猪相比,除肝脏外,其他组织sIFITM3基因的mRNA转录水平显著高于阴性猪.其中心脏组织表现最为显著,两者相差近80倍.而其他组织差异大致在1.5-4倍之间.sIFITM3基因蛋白表达结果表明,阴性猪与转基因猪sIFITM3基因的蛋白表达水平在各个组织中表达与mRNA转录水平一致.O型口蹄疫病毒攻毒后,转基因猪的体温变化及临床症状比正常阴性对照组要发病早,临床症状比较重.攻毒后抗体及中和抗体检测结果表明,转基因猪与正常阴性对照猪体内诱导的口蹄疫抗体水平差异不显著.FMDV拷贝数检测显示,转基因猪体内FMDV拷贝数在攻毒后第3天最高.此后逐渐下降到攻毒后第9天时就完全检测不到FMDV拷贝数的存在.而阴性猪在攻毒后第5天时FMDV拷贝数最高.此后也是逐渐下降,但在攻毒后11天时仍有一头猪体内能检测到FMDV拷贝数存在.这些结果表明本实验构建的过表达sIFITM3转基因猪与正常阴性对照组在抵抗FMDV的攻击时无显著差异(P＞0.05).
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