摘要
人FL(flt3 ligand)是近年发现的重要造血细胞因子，其功能类似于hSCF，主要作 用于早期原始的干／祖细胞，促进其增殖和分化，与其它细胞因子联合应用，可产生明显的协同作用。与hSCF不同的是，hFL对肥大细胞没有作用，没有种属特异性，并且可显著刺激树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NK)的增殖。这些功能使FL在造血系统原发性或继发性损伤疾病的治疗、造血干细胞移植，特别是在肿瘤免疫基因治疗和免疫瘴苗制备等方面具有重要的潜在应用价值。DCs细胞作为功能最强的抗 原提呈细胞(APC)，在免疫应答反应中起着关键作用，能诱导非特异性先天免疫反应和特异性获得免疫反应。利用FL扩增DCs的抗肿瘤免疫治疗效果，在动物模型中已得到验证。本研究利用hFL能显著刺激体内DCs增殖的生物学特性，用基因工程方法表达重组hFL，对小鼠种植瘤进行抑瘤效果试验，为进一步研究hFL在肿瘤免疫治疗中的有效作用提供实验依据。本论文主要包括两部分内容： 一、应用酵母表达系统，表达分泌性人FL(hFL)的K84E／Q122R突变体。hFL第84位和122位氨基酸的密码子分别改造为E和R的密码子，并在N端采用甲醇酵母偏爱密码子，以提高hFL的活性和表达量。将该突变体的基因克隆入酵母穿梭质粒，得到重组表达载体pPIC9K-hFL，电转入甲醇酵母，用原位双膜筛选法筛选获得Mut<'+>及Mut<'s>高表达转化子，分别进行了表达条件的优选并基本建立了分离纯化rhFL的工艺，两者最佳表达条件为：Mut<'+>转化子用BMMY培养基(pH6.0)，Mut<'s>转化子用BMMP(pH6.0)，经2％甲醇诱导96h。与Mut<'+>型相比，Mut<'s>转化子在含营养和色素较少的BMM培养基中即有高表达，且表达产物杂蛋白少，易于纯化。重组hFL表达量达30mg／L。采用Q-FF分离→浓缩→Sephacryl S-200分离纯化，步骤简单有效。回收率约为20mg／L。用内糖苷酶EndoH切除hFL N-糖链后，结果显示hFL中除N-糖基化外，可能还有其他形式的糖基化。纯化的hFL经Western印迹和N端 前10个氨基酸序列分析验证，结果与预期一致，质谱法测定其分子量为20～22kD。 生物学活性实验结果表明，单用hFL可以显著刺激小鼠骨髓有核细胞扩增，与mGM-CSF联用可以协同增强刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。 rhFL对鼠EL4淋巴瘤的抗肿瘤结果表明：小鼠皮下移植EL4淋巴瘤，连续注射14天hFL后，肿瘤比对照组减小，抑瘤率为25％左右。P<0.001，差别具有显著统计学意义。 二，应用腺病毒介导hFL与hGM-CSF进行抗肿瘤免疫基因治疗。 应用AdEasy系统，构建和包装了高表达hFL与hGM-CSF双基因的重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF。感染293细胞，培养上清中hFL24n表达量可达96ng／ml，hGM-CSF24h表达量可达306ng/ml。体外生物学实验证明，表达的hFL对小鼠骨髓有核细胞有明显增殖作用，且呈剂效关系；表达的hGM-CSF对TF1有明显的刺激增殖作用，与对照品的增殖作用相似，小鼠体内注射一次5×10<'9>pfu重组腺病毒．Ad-hFL-hGM-CSF，血清中hFL24h表达量可达25ng/ml，hGM-CSF 8h表达量可达3．3ng/ml。注射8天后，脾脏重量明显增加，细胞数增多，DC数目显著增加，为正常值的～50倍。在鼠皮下移植EIA淋巴瘤模型的治疗实验中，注射四次．Ad-hFL-hGM-CSF，5×10<'9> pfu／次，肿瘤比对照组减小，抑瘤率为30％，P值小于0．05，差别具有统计学意义。说明重组腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF对小鼠皮下移植EL4淋巴瘤具有明显的抑制作用。创新点：我们改造了hFL编码序列中2个氨基酸的密码子，并在N端采用甲醇酵母偏爱密码子，以提高hFL的活性和表达量；联合应用腺病毒介导的人FL和人GM-CSF，在体内扩增DC的数量以抑制肿瘤生长，并且，经我们改造过的腺病毒穿梭质粒使hFL和hGM-CSF两个目的基因在同一个表达载体中均获得高效表达，这迄今尚未见报道；在国内首次应用原位双膜法筛选甲醇酵母高表达转化子；应用内糖苷酶EndoH切除甲醇酵母糖基化hFL的N-糖链，检测hFL中的糖基化形式。
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