肌肉生长抑素基因的克隆、表达和基因工程疫苗的研制及在猪体上的应用

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中文摘要：肌肉生长抑制激素(myostatin，MSTN)是骨骼肌的负调控因子，是影响肌肉生长与发育的重要因素。为了促进猪生长后期肌肉的快速增长，就需要消除MSTN对肌肉的负调控作用。本研究通过基因工程的手段，从狮头鹅大腿肌肉中获得MSTN作为免疫原，并采用不同的免疫佐剂，制备了肌肉生长抑制激素的基因工程疫苗，对生长肥育猪进行主动免疫，使猪产生抗MSTN抗体，以颉颃体内产生的肌肉生长抑制激素，促进猪肌肉的生长，并分别比较以油乳剂和脂质体为免疫佐剂的两种疫苗免疫效果。 1．狮头鹅肌肉生长抑制素基因成熟肽的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据扩增的狮头鹅的MSTN基因cDNA全长序列以及成熟肽序列，设计一对引物，并分别在两引物前设计2个酶切位点BamH I和Sac I，亚克隆狮头鹅肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，经酶切、 PCR鉴定后，构建了狮头鹅原核单纯表达载体pRSETA-MSTN-m，经测序鉴定表明所克隆的MSTN成熟肽基因与Genebank上发表的鸡(AF019621)、猪(AY208121)和家鹅(AF440862)的MSTN-m核苷酸序列同源性分别可达到92％、88％、99％。而翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性可以分别达到100％、100％及 99.1％，通过IPTG诱导表达重组MSTN-m成熟蛋白，经SDS-PAGE电泳分析，原核表达产物为18.5KD的重组蛋白，为下一步制作促进猪肌肉生长的基因工程疫苗奠定了基础。 2．MSTN重组蛋白的变、复性研究及Western-blotting试验在重组MSTN-m获得表达的基础上，收集诱导表达4h的大肠杆菌BL21(DE3)菌液，用高浓度的尿素液裂解及溶解包涵体，经SDS-PAGE电泳显示，上清中有大量的表达的目的蛋白，然后经过Ni<'2+>-NTAResin对带有6个组氨酸标签的目的蛋白纯化， SDS-PAGE电泳显示纯化效果比较理想。随后进行了Western-blotting试验鉴定，证实所表达蛋白即为MSTN成熟肽蛋白，并具有免疫原性。 3．岭南黄鸡肌肉生长抑制素基因成熟肽的克隆及其真核表达载体的构建根据Genebank上登录的鸡的MSTN基因eDNA全长序列以及成熟肽序列设计一对引物，并分别在两引物前设计2个酶切位点EcoR I和Kpn I，亚克隆岭南黄鸡肌肉生长抑制激素的成熟肽蛋白编码基因，然后将特异性片段连接到pMDl8-T载体，经酶切、PCR鉴定，构建了岭南黄鸡真核单纯表达载体pPICZaA-MSTN-m。经测序鉴定表明所克隆的myostatin成熟肽基因与Genebank上发表的鸡(AF019621)、猪(AY208121)和家鹅(AF440862)的MSTN-m核苷酸序列同源性分别可达到99％、92％、86％，而翻译后的成熟蛋白氨基酸序列与鸡、猪和家鹅的同源性分别为100％、99.1％及99.1％，说明该基因的成熟肽序列高度保守，具有重要的研究价值。真核表达载体的成功构建为进一步研究该基因的功能及其酵母表达奠定基础。4.不同佐剂制备的肌肉生长抑素基因工程疫苗对猪肌肉生长影响的研究通过大量表达MSTN蛋白，分别制备了以油乳剂和脂质体为佐剂的肌肉生长抑制激素的基因工程疫苗，对猪进行了MSTN的主动免疫。结果表明，MSTN基因工程疫苗可促进猪的肌肉生长，用脂质体作佐剂其效果更明显。试验前后，脂质体组平均日增重显著高于对照组和油乳剂组(P＜0.05)，而对照组与油乳剂组间无显著差异(P＞0.05)。脂质体组的料重比显著低于对照组和油乳剂组(P＜0.05)。脂质体组的眼肌面积极显著大于对照组(P＜0.01)，但与油乳剂组差异不显著(P＞0.05)。脂质体组的瘦肉率显著高于对照组(P＞0.05)，但与油乳剂组无显著差异(P＞0.05)。油乳剂组的瘦肉率极显著高于对照组(P＜0.01)。脂质体组的肌纤维周长及面积极显著大于对照组(P＜0.01)，并且显著大于油乳剂组(P＜0.05)。结论：通过主动免疫MSTN蛋白，促进了猪的肌肉生长，以脂质体为佐剂效果更为明显。

作者：

周红蕾

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关键词：

狮头鹅岭南黄鸡肌肉生长抑制激素克隆表达基因工程疫苗猪肌肉生长

授予学位：

硕士

学科专业：

临床兽医学

导师：

侯加法、王贵平

学位年度：

2006

学位授予单位：

南京农业大学

语种：

中文

中图分类号：