摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起一种以感染猪发热、厌食，妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎，各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，与马动脉炎病毒(EAV)、小鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV)以及猴出血热病毒(SHFV)，同属尼多病毒目，动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。PRRSV为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈球形，核衣壳呈二十面体对称，囊膜表面有明显的纤突。PRRS病毒分为两个亚群，亚群A为欧洲原型(LV)，亚群B为美国原型(VR-2332)。PRRSV基因组全长约15kb，包括9个开放阅读框(ORF)，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)(ORFla和ORFIb)和7个结构蛋白(ORF2a，ORF2b，ORFs 3-7)。 本研究利用纯化的PRRSV、重组N蛋白及GP5和M蛋白基因DNA分别免疫小鼠，通过细胞融合技术，以期获得稳定分泌抗PRRsV各主要结构蛋白的单克隆抗体细胞株。 1.抗PRRSV N蛋白单克隆抗体： 本研究用纯化的PRRSV作为免疫原，腹腔注射免疫BALB／c小鼠；3周后腹腔注射等量抗原进行二次免疫；再过2周，相同剂量腹腔注射进行三免；一周后检测小鼠血清效价，达到要求后进行加强免疫，3天后，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2／0进行融合。经间接ELISA进行杂交瘤筛选，共获得2株能针对PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗，分别命名为488、4D8。间接ELISA法检测无血清培养上清McAb效价为1：32～1.128。利用间接免疫荧光(Indirect immunofluorescent assay，IFA)检测单抗特性，结果有特异性荧光，均成阳性。这2株单抗仅与PRRSV发生特异性反应，与常见猪其它病毒如猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒1型以及猪圆环病毒2型均无反应性。以表达的重组N蛋白作为检测抗原进行ELISA，证明该2株单抗针对的是PRRSV N蛋白。 以HIS融合表达的PRRSV重组N蛋白作为免疫原，制备并建立了3株稳定分泌针对猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11，其细胞培养上清效价为1：64～1：512，2F3小鼠腹水效价为1：12800。其中2F3的Ig亚类为IgM。ELISA结果显示，3株均与融合表达的HIS-N蛋白反应，而与HIS融合表达的其他蛋白不反应。Westren-blot结果显示其中单抗2F3针对PRRSV N蛋白线性表位，而单抗5Dll和4D5可能针对PRRSV N蛋白的构象型表位。2．抗PRRSV GP5蛋白的克隆抗体： 利用重组真核质粒pcDNA3-GP5免疫BALB/c小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，取脾细胞和骨髓瘤细胞sP2/O融合，经间接ELISA筛选，3次有限稀释法克隆，得到3株能稳定分泌抗PRRSV GP5蛋白单抗的杂交瘤细胞株。分别命名为4C9、5D10、5F12。其中5D10的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：64～1：1024,腹水效价为1：3200～1：10240，用IFA和IPMA检测，结果均为阳性。经Western-blot证明，这三株单抗均针对PRRSV的GP5蛋白。中和试验表明，5D10和5F12具有病毒中和活性，腹水中乖效价分别为1：40和1：80。但5D10和5F12的相对亲和力不同，证明其识别不同的抗原位点。三株细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。3．抗PRRSV M蛋白的单克隆抗体： 将PRRSVM蛋白的基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1，利用构建成的重组真核质粒免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗PRRSV M蛋白的单抗，建立间接ELISA方法筛选阳性克隆，获得3株可分泌特异性抗PRRSV M蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4G3、5F3。IA7和403的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：64～1：1024，腹水效价为1：3200～1：10240。同时用blot、IFA检测，结果均是阳性。4G3和1A7相对亲和力不同，证明其识别不同抗原位点。1A7和4G3具有病毒中乖活性，腹水中和效价达到1：96。 综上所述，本研究共获得5株分泌抗PRRSV N蛋白单克隆抗体的细胞株，3株分泌抗PRRSV GP5蛋白单克隆抗体的细胞株，3株分泌抗PRRSV M蛋白单克隆抗体的细胞株。其中有4株细胞分泌的单抗具有病毒中和作用，从而为进一步研究PRRSV主要结构蛋白抗原表位及中和表位的确定，为PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础。
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