摘要
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPs)是猪Glasser’S病的病原体，猪上呼吸道的一种共栖茵，它可在特定条件下侵入机体而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。HPs隶属于巴氏德杆菌科(Pastteurellaceae Pohl，1981)嗜血杆菌属(Haemophilus winslow et al.，1917)。HPs是一种非溶血性、非运动性、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌。目前，我国很多省市患病猪群中均可分离获得副猪嗜血杆菌，该菌已成为保育猪死亡的主要原因之一，给我国养猪业带来了巨大的经济损失，但尚无有效的预防和控制措施。本文从副猪嗜血杆菌分离株ZJ0402生物学特性的研究及菌株毒力的测定、副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立及副猪嗜血杆菌灭活疫苗仔猪免疫保护效力三个方面进行了系统的研究。结果如下： 1．副猪嗜血杆菌分离株ZJ0402生物学特性研究：本研究对本实验室分离的HPs分离株ZJ0402的培养特性、生化特性、对化学消毒剂的敏感性、灭活方法及保存方法进行了研究。结果为：(1)该分离菌株培养过程中最适辅酶补充量为0.002％、最适培养时间为10h； (2)1～9代菌株的生化特性为发酵木糖、山梨醇，尿素、鸟氨酸脱羧酶试验结果为阳性； (3)1：10000稀释的苯扎溴铵和1：3000稀释的过氧乙酸可有效杀灭该菌，而1：40稀释的复方次氯酸钠和1：800稀释的蓝光消毒剂灭菌效果较差； (4)通过菌体灭活试验确定0.2％甲醛作为最佳的灭活剂浓度，最佳灭活条件为37℃灭活14h； (5)保存方法：HPs于20％甘油中，置-20℃可保存2个月，置-50℃可保存4个月，冻干后置于-50℃冰箱至少可保存一年，为研制副猪嗜血杆菌灭活疫苗奠定了重要基础。 2．副猪嗜血杆菌分离株ZJ0402毒力的测定：以不同剂量的副猪嗜血杆菌分离株通过鼻腔接种的方式感染断奶仔猪，攻毒剂量分别为1.03×10<'9>CFU／头、1.03×10<'7>CFU／头和1.03×10<'5>CFU／头，攻毒后观察10天，每天观察临床症状，剖检濒死及病症严重猪、分离细菌并观察病理变化，计算日增重确定各攻毒剂量对仔猪生长状况的影响。结果，通过鼻腔接种1.03×10<'9>CFU／头和1.03×10<'7>CFU／头HPs都可以引起仔猪格氏病(Glasser′S disease)，其中攻毒剂量为1.03×10<'9>CFU／头可引起仔猪Glasser′s的典型临床症状和病理变化。结果表明，1.03×10<'7>CFU/头可作为仔猪对HPs的最小感染剂量，并作为免疫攻毒保护试验中攻毒剂量的参考依据。3．副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立：采用福尔马林灭活的副猪嗜血杆菌全菌体作为包被抗原，建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。经试验确定副猪嗜血杆菌全菌体的最佳包被浓度为2.24×10<'7>CFu/孔，待检血清最佳稀释度为1∶200稀释，以及间接ELISA的最佳反应条件。将该方法应用于临床，14个发病猪场100份血清检测结果HPs抗体阳性检出率为94％，明显高于细菌分离鉴定检测结果。并通过实验证实该方法具有很高的特异性和重复性。4．副猪嗜血杆菌灭活疫苗仔猪免疫保护效力研究：以副猪嗜血杆菌分离菌株菌液用甲醛灭活后制成油乳剂灭活疫苗，用含不同菌数的副猪嗜血杆菌油乳剂灭活疫苗免疫断奶仔猪，首次免疫后3周以同样剂量和途径加强免疫1次，同时设立空白对照组，第2次免疫后2周由鼻腔途径攻毒，通过ELISA抗体检测、临床症状观察、病理剖检评价该疫苗免疫效果。结果为，仔猪免疫该苗后无异常临床表现。以8.76×10<，8>。CFU/头免疫剂量首次免疫后第7天即可检测到ELISA抗体，首免后35天ELISA抗体水平达高峰，首免后5周可有效保护免疫猪免受同源副猪嗜血杆菌菌株攻毒发病。结果表明，该疫苗具有良好的安全性和保护效力。本研究成功建立了副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法，具有较高的特异性和重复性；确定了该株副猪嗜血杆菌菌种标准；通过免疫攻毒保护试验证实了该研究中制备的副猪嗜血杆菌灭活疫苗具有较好的保护效果，从而为该病的有效防制奠定了重要基础。
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