摘要
Toll样受体(toll-like receptor,TLRs)是一类主要表达在树突状细胞(dendriticcells,DC)、巨噬细胞等抗原提呈细胞(antigen-presenting cells,APC)上的跨膜蛋白,其识别病原体来源的产物,如TLR4识别革兰阴性菌的LPS;TLR3识别病毒感染时产生的双链RNA,而TLR9识别原核染色体和DNA病毒中的未甲基化CpG DNA基序等.TLRs在宿主免疫系统对病原体的抵御过程中起着关键性的作用,可以说TLRs控制着APC对适应性免疫应答的激活.Dc是体内功能最强的APC,也是唯一能活化初始T细胞(naive T cell)的APC,在特异性激活初始T细胞、联结天然免疫和获得性免疫应答中发挥独一无二的作用.DC的成熟在免疫应答中具有重要意义,是激活T细胞、启动免疫应答的必要条件.表达在DC上的TLRs能识别各种不同的微生物或病毒,与相应配体结合后能引起IL-6、IL-12等前炎症因子的分泌、共刺激分子的上调为特征的DC活化.TLRs介导的信号转导途径分为MyD88依赖途径和MyD88非依赖途径.当前的TLR信号模型学说认为MyD88是TLR2、5、7、8、9转导信号的唯一接头分子,而TLR3依赖TRIF-IRF3介导的途径在识别病原后产生IFN-β.TLR4的信号转导至少通过两条途径,其中,MyD88依赖途径是TLR4介导细胞因子分泌所必需的,而另外一条MyD88非依赖途径是它介导上调表达共刺激分子和MHC分子所必需的.近来研究发现不同TLRs的联合可以产生更为迅速持久的DC活化,并且倾向于诱导Th1型反应,而诱导机体产生抗原特异性的Th1型免疫应答是抗肿瘤免疫和抗感染免疫的关键点之一.此外,越来越多的研究认为TLRs和调节性T细胞有密切关联,后者能抑制DC成熟、T细胞分化和IL-2分泌,是启动适应性免疫应答的又一调控点,而在肿瘤部位的调节性T细胞也是肿瘤细胞逃避机体免疫攻击的机制之一.TLR配体介导的信号可以扭转调节性T细胞的抑制作用.因此,本实验以TLR配体(LPS、Poly I:C或CpG-ODN)单独或联合激活DC瘤苗,观察TLRs联合刺激对DC表型、功能等的影响,进而在体内用EG7肿瘤模型研究该种经TLR配体单独或协同刺激的DC瘤苗对肿瘤的抑制作用及其相关免疫学机制. 目的: 观察用TLRs联合激活的DC瘤苗对C57BL/6小鼠EG7(用OVA转染的EL4)肿瘤模型的抑制作用并探讨其可能的机制,为抗肿瘤治疗新方法提供实验依据. 方法: 1.在体外用TLR配体单独或联合刺激DC:取6-8周龄C57BL/6小鼠,无菌分离股骨、胫骨,冲洗骨髓.将收集到的骨髓细胞破去红细胞后用DC培养基(mGM-CSF 10ng/ml,mlL-4 lng/ml的完全培养基)孵箱培养,在培养的第2天小心弃去非黏附或疏松结合细胞,在培养的第6天用OVA刺激后分别用LPS、PolyI:C、CpG-ODN、LPS+PolyI:C、PolyI:C+CpG-ODN刺激,24h后收集细胞,得DCovALPS、DCovAPolyI:C、DCovACpG-ODN、DCovA(LPS+PolyI:C)、DCovA(PolyI:C+CpG-ODN),然后检测各组DC表面CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ类分子(Iab)的表达,细胞上清中IL-6、IL-12p70、IL-23、INF-β的分泌水平以及各组DC刺激T细胞增殖能力的大小. 2.建立EG7肿瘤模型:C57BL/6小鼠品系,每组8只,共设7个组,分别为DC<,OVA>LPS组、DC<,OVA>PolyI:C组、DC<,OVA>CpG-ODN组、DC<,OVA>(LPS+PolyI:C)组、DCovA(PolyI:C+CpG-ODN)组和DC<,OVA>组,PBS为阴性对照组.各组中小鼠均右大腿外侧皮下接种EG7细胞,1×10<'6>cells/50μl/只. 3.用OVA作为抗原,观察各组DC瘤苗对EG7肿瘤的抑制作用:在肿瘤接种后第7天,用前面制备的DC瘤苗双侧腹股沟皮下注射(s.c.)治疗各组荷瘤小鼠.1×10<'6>cells/100μl/只,每侧注射50μl.末次治疗后第7天,随机取各组荷瘤小鼠脾细胞检测CD4<'+>CD25M<'+>调节性T细胞比率并诱导细胞因子和CTL.然后用LDH释放法检测NK、CTL杀伤活性,用ELISA试剂盒检测Th1/Th2细胞因子并观察记录肿瘤生长情况以及各组小鼠存活期. 4.数据分析:数据用SPSS软件处理,二次方差分析,当P<0.01时认为有统计学意义. 结果: 1.用TLR配体联合激活的DC无论在表型还是功能上都比单一配体刺激的DC具有更高的成熟度(P<0.01):TL,Rs联合尤其是TLR3和TLR9的联合在活化DC时在细胞因子(如IL-12p70、IL-23、IFN-β、IL-6)的分泌、共刺激分子(如CD40、CD80、CD86分子)和MHC Ⅱ类分子的表达以及刺激同种异体T细胞的增殖等方面都存在显著的协同效应. 2.在小鼠EG7肿瘤模型中,用TLRs联合激活的DC瘤苗进行腹股沟皮下注射治疗,显著抑制了肿瘤的生长,且存活时间明显延长:用TLR配体联合激活的DC瘤苗治疗后的DC<,OVA>(LPS+PolyI∶C)组和DC<,OVA>(PolyI∶C+CpG-ODN)组荷瘤小鼠的肿瘤显著小于单独刺激治疗组或DC<,OVA>组或PBS对照组(与单独刺激治疗组或DC<,OVA>组或PBS对照组比较,P<0.01),而存活期显著长于单独刺激治疗组或DC<,OVA>组或PBS对照组(与单独刺激治疗组或DC<,OVA>组或PBS对照组比较,P<0.01),且存活率显著提高. 3.用TLRs联合激活的DC瘤苗的治疗增强了荷瘤小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性:TLR配体联合激活的DC<,OVA>(LPS+PolyI∶C)组和DC<,OVA>(PolyI∶C+CpG-ODN)组来源的小鼠NK细胞和CTL杀伤活性与用TLR配体单独激活的DC瘤苗治疗组相比显著增高(P<0.01). 4.用TLR3、4、9激活尤其是联合激活的DC瘤苗能诱导荷瘤小鼠产生更多的Th1型细胞因子(IL-2)的分泌:DCovALPS组、DCovA PolyI:C组、DCovACpG-ODN组、DCovA(LPS+PolyI:C)组、DCovA(PolyI:C+CpG-ODN)组,DCOVA组上清中Th1型细胞因子IL-2的分泌量显著高于PBS对照组(p<0.01),而联合刺激组DCovA(LPS+PolyI:C)组和DC<,ovA>(PolyI:C+CpG-ODN)组Th1型细胞因子IL-2的分泌量显著高于DC<,ovA>LPS组或DCovAPolyI:C组或DC<,ovA>CpG-ODN组或DCovA组(与单独刺激组或DC<,ovA>组比较,P<0.01). 5.用TLR3、4、9激活尤其是联合激活的DC瘤苗能减少荷瘤小鼠脾细胞中的CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞比率. 结论 1.TLR配体联合激活的DC无论在表型还是功能上都具有更高的成熟度,且能分泌更多的IL-12、IL-23等细胞因子. 2.TLR配体联合激活的DC瘤苗能显著抑制肿瘤生长,并延长小鼠生存期,其可能的机制与增强荷瘤小鼠NK和CTL杀伤活性,并加强Thl型细胞因子分泌以及减少荷瘤小鼠脾细胞中的CD4<'+>CD25<'+>调节性T细胞比率有关. 3.TLR配体联合激活的DC瘤苗可望为开辟新型的基于DC的肿瘤疫苗提供了新的思路.
NETL