摘要
为了研究鸡贫血病毒(Chicken anemiavirus,CAV)VPI蛋白的抗原表位,本研究根据生物软件Lasergene对VPl蛋白抗原性的分析结果,将VPI蛋白进行了分段表达,选取缺失VPI N端68个氨基酸的融合表达产物VPI-A进行纯化,免疫BALB/c鼠,制备了6株抗VPl蛋白的单克隆抗体(MAb).以这些MAbs对分段表达的VPI蛋白进行Western blot分析,在VPl蛋白上初步鉴定出3个抗原位点,分别位于:VPI的219-274氨基酸(aa)残基、324-369aa和275-302aa残基内. 为了更详细而全面地了解VPl蛋白的抗原结构,构建了vpl基因特异性噬菌体展示肽库,利用多克隆抗体对肽库进行3轮淘选,得到9个阳性噬菌体.序列分析表明,有5个克隆展示有相同的序列"T<'309>YMSFATLTALGAQWSFPPGQRSVSRRSFNHHKARG<'344>",有4个克隆展示有相同的序列"M<'169>.FGGWHLFRHIETRFQLLA<'214>".利用制备的6株MAbs与这些阳性噬菌体进行Westernblot分析,结果表明2F3等4株MAbs与噬菌体P12反应.为了对这4株MAbs及MAb 4D5对应的表位精确定位,人工合成一系列成对的寡核苷酸,退火后插入pET32a载体中进行融合表达.利用MAbs对融合蛋白进行Western blot反应性扫描,鉴定出2F3等4株MAbs对应的表位位于D<'245>HQNRWRKG<'245>.利用同样的方法鉴定出MAb 4D5对应的表位位于W<'353>HTLVPLGTE<'362>. 根据生物软件Lasergene对VP2蛋白的分析发现该蛋白具有良好的抗原性,为了对其进行表位作图(epitope mapping),首先在E.coli中克隆、表达了VP2蛋白全长,纯化后免疫BALB/c鼠,制备了7株抗VP2蛋白的单克隆抗体.人工合成一套彼此重叠6个氨基酸长度为16个氨基酸并覆盖VP2全长的短肽,融合表达后与MAbs进行Westem blot和ELISA反应性扫描,鉴定出3个抗原表位, 分别为G<'21>QPGPSGAAQGQVISN<'36>,Ll<'111>EDRSTQASLEEAILR<'126>和E<'121>EAILRPLRVQGKRAK<'136>,而G<'16>'AAQ<'20>,Q<'117>ASL<'120>和p<'127>LRV<'130>.分别为各表位的的主要功能区.用这3个纯化后的融合短肽免疫BALB/c鼠,结果表明这些融合蛋白均能诱导小鼠产生VP2蛋白的特异性抗体. 为了研究vp3基因对病毒复制及致病力的影响,构建了CAV的感染性克隆及vp3完全缺失(pBluem2CAVVP3')和NLS2缺失(pBluem2CAVNLS2')的两个突变体.首先构建了含有CAV双拷贝基因组顺向串联的重组子,转染MDCC-MSBI细胞,获得了能够自我复制的CAV,体内试验显示该质粒注入鸡体内,可以引起与CAV感染相似的病理变化.又对vp3基因及vp3基因C端的核定位信号(Nuclear location signal NLS)进行缺失,分别构建了带有缺失的突变体pBluem2CAVVP3<'->和pBIuem2CAVNLS2<'->,转染MDCC-MSBI细胞,初步证实vp3基冈缺失后在体内体外均检测不到病毒复制,但vp3 C端NLS2缺失后在体外可以检测到病毒复制,而体内试验结果显示NLS2缺火的突变体可以引起鸡胸腺小体数目增多等变化.CAV感染性克隆的构建为获得纯化的病毒及研制新型疫苗奠定了基础,两个vp3基因突变体的构建为研究vp3基冈功能及获得毒力减弱的病毒奠定了基础..
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