HSP90家族是一类高度保守的组成型蛋白,非应激条件下含量丰富,约占整个细胞内蛋白的1-2%,应激会增加它的表达量.H SP90家族在体内多为二聚体,由三个功能结构域组成:N-末端能够结合ATP,C-末端能够促进二聚化并结合多种辅助伴侣分子,中间链接区具有ATPase活性且能够结合各种客户蛋白.单体的HSP90不具备生物活性功能. HSP90家族是一类特异的ATP依赖性的分子伴侣,能够活化和调节多种涉及细胞信号转导和调节的蛋白.早期认为它可协助变性蛋白从高温或其它应激环境中复性.近年来的研究显示HSP90家族具有广泛的生理功能,参与调节多种蛋白质在非应激条件下的生物活性,其中包括调节DNA的复制、转录,亚细胞结构的蛋白质转移,细胞信号转导、免疫应答、以及生长、发育、凋亡等. 从番茄cDNA文库中克隆到的Leap84位于染色体中,全长2588bp,表达产物定位于细胞质中.序列分析证明LeHSP84是HSP90家族的一员.本实验将Lehsp84基因定向克隆于带有组成性表达启动子CaMV35S和NPTⅡ基因(带有卡那霉素抗性基因)的植物表达载体pROKⅡ中,冻融法转化农杆菌LBA4404,利用叶圆盘法对烟草进行Ti质粒介导的遗传转化.用含卡那霉素的培养基筛选抗性苗.分别提取转基因烟草叶片基因组DNA、RNA,PCR结果表明hsp84基因已整合进烟草基因组中;Northern blot结果证明HSP84为组成型表达且转基因使得表达量明显增加. 1)PCR及Northern Blot:PCR结果显示转Lehsp84基因的烟草叶片DNA序列用NPTⅡ引物能扩增特异DNA片段,而对照烟草未见特异条带,说明Lehsp84基因确实已导入烟草中.Northern blm结果显示转基因烟草常温下HSP84表达量要高于对照,说明外源Lehsp84基因已经在植物体内得以表达. 2)烟草耐热性:将对照及转基因烟草植株置于48℃下热激处理6h,28℃恢复10-20天,观察发现转Leap84基因烟草生长良好,而对照烟草生长明显受到抑制.50℃处理后对照烟草和大部分转基因烟草很快死亡,仍有部分转基因烟草能萌发幼芽.热激后对照烟草的叶绿素含量要明显低于转基因烟草.表明过量表达HSP84可提高烟草的抗热性.3)转基因烟草抗盐性:将对照及转基因烟草用100mmol/LNaCI和150mmol/LNaCl处理7-8天,测定叶片中MDA含量和SOD酶活性.结果显示,转基因植株MDA含量要低于对照植株,SOD活性要高于对照,但差异不显著.各种盐浓度处理转基因烟草和对照烟草在生长表型上均未见明显差别.实验结果证明过量表达HSP84没有提高烟草的耐盐性.4)转基因烟草抗冷性:将对照烟草和转基因烟草置于5-8℃以下低温处理3周.测定结果显示转基因烟草MDA含量要低于对照,而SOD活性要高于对照,但差异很小.转基因植株生长活性和对照相比没有差异.实验可初步认为过量表达HSP84并没有提高烟草的耐冷能力.
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