摘要
N-糖酰胺酶(Peptide-N<'4>-(N-acetyl-β-D-glucosaminyl)asparigine amidase；Peplide．N-Glycanase；EC 3.5.1.52)是一类可以水解N-连接的糖肽或糖蛋白的β-天冬胺酰葡糖胺键，释放出完整的寡糖链，并生成天冬氨酸残基的酶。在真核生物中，N-糖酰胺酶(Pnglp)与蛋白酶依赖的蛋白降解系统相联系，对从内质网反转运到细胞质的错误折叠的糖蛋白进行脱糖基化处理。Pnglp广泛地存在于真核生物体内，主要存在于细胞质中内质网的周围。 真核生物中的Ⅳ．糖酰胺酶(Pnglp)能够区分天然的和非天然的糖蛋白。在本论文中首先研究底物的结构同Ⅳ-糖酰胺酶脱糖基化活性之间的关系。将核糖核酸酶B用两种方法不同程度变性之后，使用圆二色光谱检测其结构。同时，在体外研究大肠杆菌表达的酵母Ⅳ-糖酰胺酶对核糖核酸酶B的脱糖基化活性与底物结构之间的关系。结果证实底物的结构确实能够影响Ⅳ．糖酰胺酶的脱糖基化活性，并且脱糖基化的效率同底物蛋白的活性成线性关系。对于核糖核酸酶B来说，脱糖基化的临界点分别时是60-65℃和40-60 mM的DTT。 在体内，N-糖酰胺酶通过Rad23p与26S蛋白酶体相连接，糖蛋白的降解是被Pnglp-Rad23p复合体来调节的。本研究中，在体外纯化出Pnglp-Rad23p复合体并检测了各种性质。体外试验中发现，Pnglp-Rad23p复合体表现出比Priglp更高的活性。同时证明，Pnglp-Rad23p复合体还具有区分天然的和非天然的糖蛋白的能力。此外底物的结构能够影响Pnglp-Rad23p复合体的脱糖基化效率，并且对于核糖核酸酶B脱糖基化的临界点，Pnglp-Rad23p复合体是与Priglp相同的。Pnglp-Rad23p复合体的脱糖基化反应的最适温度为30℃，最适pH为pH7.0，这些都与Pnglp相类似。Pnglp-Rad23p复合体比Pnglp表现出更高的活性，并有更广的温度和pH适应性。 在酵母中，Pnglp的Rad23p结合区是由N-端和C-端的4个富含疏水氨基酸的α-螺旋(H1，H2，H11，H12)和N-端螺旋之前的一些伸展序列组成的。N-端螺旋H1伸展出来，与C-端的螺旋H12组成45°角，直接与Rad23p中的四个α-螺旋通过氢键、疏水作用和离子对相互连接。在本研究中，实验检测了Pnglp切除N-端和C-端的4个富含疏水氨基酸的α-螺旋(H1，H2，H11，H12)之后的改造体与Pnglp的活性比较。 体外脱糖基化实验结果显示Png1-△(H1，H12)、Png1-AH12和Png-△(H1，H2，H11，H12)没有活性，而Png1-△H1具有比Pnglp更高的活性。同时，Png1-△H1不仅能对变性的糖蛋白脱糖基化还能作用于天然的糖蛋白。进一步实验证明底物的结构能够影响Png1-△H1的脱糖基化效率。Png1-△H1的脱糖基化反应的最适温度为30℃，最适pn为pH7.0，这些都与Pnglp性质相同。经过对Png1-△H1的结构进行建模处理，分析其在水中的动力学并与Pnglp在水中的动力学进行比较后发现，N-端螺旋H1切除之后，Pnglp的活性中心裂隙的结合部分和两端的边缘区域柔性明显增大，这三个区域会对底物同酶的结合产生较大的影响。
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