摘要
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖重复单位通过β-(1→4)糖苷键和β-(1→3)糖苷键构成的无分支高分子糖胺聚糖，广泛存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的夹膜中。其相对分子质量(Mr)-般为1×10<'5>～1×10<'7>D，分子中两种单糖的摩尔比为1：1。HA常用的制备方法有动物组织提取法和细菌发酵法。 人们对HA的结构、性质和生理功能都进行了较为充分的研究，其在临床上的应用也日益广泛。目前所用的HA的平均Mr一般都大于1×10<'5>D，HA寡糖(oligosaccharides ofhyaluronan，o-HA)是．Mr 1×104 D以下、单糖残基数量为2～40的HA分子片段。o-HA属于小分子多糖，其性质与普通HA有很大不同，甚至具有完全相反的作用。本课题重点研究了o-HA的制备方法、理化性质、结构分析及其促血管生成活性和抑制肿瘤的多药耐药作用。 1 o-HA的制备方法和分离方法研究研究了用透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)酶解制备o-HA的方法，对方法中主要的影响因素采用正交试验设计进行了优化。HAase催化HA水解受温度、pH值、酶浓度、底物浓度、反应时间等因素的影响。HAase催化HA水解的最适反应条件是底物浓度为10 g/L，酶浓度为1.5×10<'5>U/L，pH 5.0，反应温度为50℃。 o-HA的纯度对于细胞实验和结构的确定十分重要，所以采用Bio-gel P6进行分离，并通过对各样品的紫外(UV)光谱、红外(IR)光谱、质谱(MS)等的结果分析确定通过该分离方法制得的样品为o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10四种寡糖。 2 o-HA的促血管生成活性研究探讨了o-HAs对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的影响及其促血管生成作用。采用噻唑蓝(MTT)法观察o-HAs对于HUVEC的增殖作用；并研究了o-HA在鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM)中的促血管生成作用。证明了。-HA6、o-HA8、o-HA10有促血管生成作用，o-HA4没有此作用。o-HA6、o-HA8、o-HA10在18.75～150μg/mL的浓度范围内可以促进HUVEC增殖，并且这3种寡糖表现出较为一致的影响作用。 3 o-HA的抑制肿瘤细胞的多药耐药性研究本研究对o-HAs的体外逆转白血病多药耐药细胞(K562/A02)的耐药性并其逆转机制进行探讨。以MTT法检测o-HAs对K562/A02细胞的多药耐药逆转活性；以流式细胞术检测。o-HAs对K562/A02细胞内抗癌药物阿霉素(ADR)累积的影响。o-HAs在体外具有较强的逆转K562/A02细胞多药耐药的活性，在100 μg/mL浓度时o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10使ADR对K562/A02的半数抑制浓度(IC<,50>)由61.6μg/mL分别降低至30.17、30.04、32.29、33.33μg/mL。细胞中ADR的累积量增加至原来的3.90、3.92、3.76、3.39倍。 本课题的主要成果： (1)通过实验确定HAase催化HA水解的最适反应条件：底物浓度为10 g/L，酶浓度为1.5×10<'5>U/L，pH 5.0，反应温度为50℃。确定分离的色谱条件，制得o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10四种寡糖。 (2)研究o-HA的促血管生成作用，首次将o-HA4、o-HA6、o-HA8、o0HA10进行比较研究，证明了o-HA4没有促血管生成作用，o-HA6、o-HA8、o-HA10有此作用，且三者没有显著性差异。 (3)研究o-HA逆转K562/A02细胞的多药耐药性，证明了o-HA4、o-HA6、o-HA8、o-HA10具有抑制K562/A02细胞的多药耐药性的作用。 本研究对寡糖的制备、分离纯化具有指导意义，为o-HA的药用开发奠定了基础。
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