摘要
在对动脉粥样硬化的研究中，新西兰大白兔是一种合适的动物模型，由于兔脂联素的序列尚未见报道，限制了利用该模型对脂联素的抗动脉粥样硬化作用进行深入研究。这些问题构成了本研究的设计思路和研究目的。研究目的1．克隆新西兰大白兔脂联素cDNA并完成测序。 2．体外表达新西兰大白兔脂联素蛋白质，明确克隆的基因含完整的开放性阅读框架(ORF)。 3．探讨不同年龄组的新西兰大白兔脂联素基因表达的变化，明确年龄与脂联素表达的关系。 4．探讨高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素基因表达的变化，明确高脂血1.新西兰大白兔脂联素cDNA序列的测定(1)取普通饲料喂养的3月龄正常雄性新西兰大白兔颈背部皮下脂肪组织约100mg用于RNA的提取。 (2)脂肪组织RNA提取：使用Trizol试剂从组织中提取总RNA。 (3)兔脂联素基因片段的克隆：按照M-MLV逆转录酶试剂盒说明书配逆转录反应体系。根据人和小鼠脂联素高度保守序列设计PCR反应引物。上游引物：5'-ACACCTCCAGGGCTCAGGATGCT-3'，下游引物：5'-TCAGTTGGTATCATGGTAGAGAAG-3'。PCR反应后产物经琼脂糖凝胶电泳检测，割胶回收。并将其克隆入pGEM-T载体内，按试剂盒说明书操作。终产物命名为pGEM-T-APN。 (4)pGEM-T=APN连接反应产物转化大肠杆菌JM109，筛选阳性重组体。 (5)阳性重组体的菌落37℃摇床扩增，送上海英骏公司测序。 2.新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达与纯化采用pGAPZ<,α> Pichia ExpressionKit(hwitrogen)试剂盒。 (1)以脂肪组织总cDNA为模板，用含EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物重新克隆脂联素DNA，并将产物插入pGEM-T载体，产物命名为pGEM/APN，经测序证实联结正确。 (2)产物pGEM/APN与pGAPZ<,α> Pichia酵母双酶切(.EcoRI和Not Ⅰ)，将脂联素DNA插入pGAPZ<,α>Pichia酵母表达载体中，得到产物pGAPZ<,α>-APN。 (3)将pGAPZ<,α>-APN转化大肠杆菌DH5α，在低盐LB培养基中扩增，抽提质粒，电转入GS115酵母菌株，培养，挑取阳性单克隆。 (4)阳性单克隆在YPD培养基中培养，脂联素蛋白质分泌入上清液中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，Western blot分析蛋白质分子量大小。 (5)酵母培养液中脂联素浓度分析利用大鼠抗人脂联素ELISA试剂盒分析酵母上清液中脂联素浓度。 3.年龄因素对新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的影响选取2周龄、1月龄、3月龄、6月龄、12月龄雄性新西兰大白兔各10只，3％ 戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后，各取颈背部皮下脂肪组织约100mg用于RNA的提取。荧光实时定量PCR检测脂肪组织mRNA的表达，ELISA试剂盒分析血清中脂联素浓度。 4．高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化为研究高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化，3月龄雄性新西兰大白兔12只，体重1.5～2 kg，1％高胆固醇饲料喂养，由山东省农科院购买。分别于高胆固醇饲料喂养前及喂养后第1、2、3、4月时间点取脂肪组织和静脉血标本。荧光实时定量PCR检测脂肪组织mRNA的表达，ELISA试剂盒分析血清中脂联素浓度。 5．统计学分析：数据采用均数±标准误(mean±SEM)表示。组间比较采用方差分析，所有数据均用SPSS 13.0软件包处理，P<0.05为统计学有显著性差异。 结果 1．新西兰大白兔脂联素cDNA序列测定经RT-PCR方法克隆出兔脂联素cDNA，测序证实含完整的开放性阅读框架(ORF)，即包含起始密码子(atg)和终止密码子(tga)。核苷酸序列分析显示兔脂联素cDNA序列与人、小鼠同源性分别为86.39％和81.45％，氨基酸序列的同源性分别为85.66％和85.25％。 2．新西兰大白兔脂联素蛋白质的体外表达Western blot分析证实，GS115酵母上清液中含脂联素蛋白质，分子量约30 kDa。ELISA分析，上清液中蛋白质浓度为0.29±0.02μg/ml。 3．年龄因素对新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的影响荧光实时定量PCR检测结果显示，不同年龄组的新西兰大白兔皮下脂肪组织脂联素mRNA表达有显著性差异(P<0.01)，在1月龄组最高，然后随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。 血清脂联素浓度ELISA分析结果显示，不同年龄组的新西兰大白兔血清脂联素浓度有显著性差异(P<0.01)，在1月龄组最高，然后随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。 4．高胆固醇饲料喂养后新西兰大白兔脂联素蛋白质表达的变化高胆固醇饲料喂养后，脂肪组织脂联素基因mRNA转录与血清HDL-C浓度成正相关(Pearson Correlation=0.469，P=0.001)，在对照组无此相关性。在高脂组和对照组，不同的时间点脂肪组织脂联素基因mRNA转录均不同(Repeated MeasurementsAnalysis of Variance，P<0.01)；在高胆固醇饲料喂养前，2组之间脂联素基因mRNA转录无显著性差异(P>0.05)；在高胆固醇饲料喂养后1、2、3、4月固定的时间点上，2组之间脂联素基因mRNA转录有显著性差异(P<0.01)。高胆固醇饲料喂养对脂联素血清浓度有相似的影响：脂联素血清浓度与血清HDL-C浓度成正相关，在对照组无此相关性。在高脂组和对照组，不同的时间点脂联素血清浓度均不同：在高胆固醇饲料喂养前，2组之间脂联素血清浓度无显著性差异(P>0.05)；在高胆固醇饲料喂养后1、2、3、4月固定的时间点，2组之间脂联素血清浓度有显著性差异(P<0.01)。 结论 1．兔脂联素cDNA序列、氨基酸序列与人、小鼠均有高度的同源性，脂联素基因在兔、人、小鼠具有相似的功能。 2．在不同的年龄组脂联素基因表达存在显著性差异，在1月龄组最高，随年龄增加而呈现出与年龄相关的下降趋势。 3．脂质代谢异常对脂联素的基因表达有显著性影响，脂联素与血清高密度脂蛋白胆固醇成正相关。 通过抑制核转录因子KB(nuclear factor KB，NF-KB)，脂联素抑制TNF α诱导的粘附分子的表达，抑制丝裂原活化蛋白(mitogen activated protein，MAP)通路进而抑制生长因子诱导的平滑肌细胞的增殖。在巨噬细胞，脂联素抑制清道夫受体的表达和泡沫细胞的形成。因此，脂联素积聚在内皮细胞损伤的部位，发挥抗动脉粥样硬化的保护性效应。 目前国内、国际对脂联素与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化的关系及作用机制方面做了大量的研究，但有许多问题尚未明了： 1．在动物实验中观察到了脂联素减轻动脉内膜的增厚，降低动脉平滑肌细胞的增殖和迁移。脂联素是通过什么途径实现这种作用的? 2．血管周存在脂肪组织，局部脂肪组织分泌的脂联素能否通过血管外膜影响动脉粥样硬化斑块的发生与发展? 3．在动脉粥样硬化血管壁，通过转染携带脂联素基因的腺病毒，在体观察斑块的形态学改变如何，目前尚未见相关报道。 以上这些问题，构成了本研究的设计思路和研究目的。 研究目的 1．对比脂联素通过内膜与外膜对动脉粥样硬化斑块的作用。 2．观察脂联素对斑块易损性的影响。 结论 1．动脉粥样硬化病变血管内膜或外膜局部转染Ad-APN后，斑块的面积缩小，同时，血清脂联素浓度明显升高，脂联素可通过抑制血管壁黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达发挥抗动脉粥样硬化的作用；脂联素通过血管外膜或内膜对动脉粥样硬化的作用是一致的。 2．血管内膜或外膜局部转染Ad-APN后，脂联素对血管壁Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达没有影响。 3．局部转染脂联素基因后，动脉粥样硬化斑块内胶原的含量虽然无明显变化，而斑块内平滑肌细胞量的增加，脂质含量和巨噬细胞的数量降低，可使斑块的易损性降低。
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