短串联重复序列(STR，short tandem repeats)或称微卫星DNA(microsatelliteDNA)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的。DNA序列，由2～6bp顺序相同的重复序列单位(又称核心序列)首尾串联重复排列组成。作为第二代遗传标记，STR分析已被广泛应用于遗传制图、遗传连锁性分析、亲子鉴定、疾病基因定位、物种多态性研究和组织移植评价等诸多领域。随着STR分析技术的迅速发展，其在法庭科学领域中的作用也愈来愈大，现在基于STR技术的STR—PCR．分型已经成为了国内外法医个人识别和亲子鉴定最主要的手段。 但是，在法医DNA检验经常面临DNA降解的检材，检材所处环境的温度、湿度、光、化学及生物因素，尤其是酸或碱、高温、潮湿、暴晒、微生物等因素都会导致DNA分子受到损害，DNA链发生断裂，DNA片段的完整性受到极大的破坏。这种现象在陈旧的骨骼、牙齿以及腐败的肌肉组织中尤为常见，在应用商品化STR试剂盒进行DNA分型时可能会出现“优势扩增”或者“无效扩增”，主要表现为：扩增片段较大的STR基因座扩增效率降低，出现等位基因缺失甚至完全丢失。因此，进行高度降解的DNA的STR分型成为法医检验的难点。虽然也可以应用线粒体DNA高变区(mitochondrial DNA hypervariable region)来对腐败降解的检材进行分析，但对于许多法庭科学实验室来说，线粒体DNA的检测费时费力，而且成本较高，另外线粒体DNA呈单倍体母系遗传，个人识别力远低于STR，不能进行个人认定。 STR基因座的多态性表现为个体间核心序列重复次数的不同。STR-PCR分型技术的策略是设计含括重复序列的引物对其进行了PCR扩增，然后通过电泳分离扩增产物，检测其片段长度的差异，从而进行STR等位基因分型。引物位置决定PCR产物的大小。在设计引物时，使其尽可能结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，使PCR扩增产物尽可能缩短，这就是miniSTR技术。与目前常用的STR基因座相比，其扩增片段明显缩短，对降解的DNA小片段分型成功率更高，但由于核心序列的重复次数没有改变，因而分型结果与目前常用的体系相同。本课题旨在建立新型的miniSTR复合扩增体系，并对其法医学应用进行研究。主要研究内容及结果如下： (一)建立三个荧光标记miniSTR复合扩增体系按照复合扩增基因座选择的原则和实验尝试，设计引物，组合并建立三个miniSTR复合扩增体系，其中miniCTTA体系包含CSFlPO、TPOX、TH01和Amelogenin基因座；miniDDD体系包含D5S818、D8S1179和D16S539基因座；miniDDV体系包含D13S317、D21S11和vWA基因座。对各个体系的扩增条件分别进行优化，包括退火温度、引物浓度、缓冲液的组成、酶的用量以及Mg<'2+>浓度等：PCR反应条件，成功地建立了三个荧光标记miniSTR复合扩增体系并制备其相应的等位基因分型标准物。三个体系各基因座的扩增片段缩89～211bp，分别较商品化试剂盒产物片段缩短25～191bp。比较对100个样本：miniSTR体系和商品化试剂盒的分型结果，显示分型结果一致，分型准确。 对15种常见的动物(猴、猪、狗、牛、羊、鸡、鸭、鱼、猫、兔、豚鼠、家鼠、鳝鱼、蛙和人)提取DNA后进行扩增，发现其具有人的种属特异性。梯度稀释Control DNA 9947(浓度为0.1ng/μl)，测定miniSTR复合扩增体系的灵敏度，显示其灵敏度可达50pg。 (二)应用链霉亲和素磁珠分离手段建立两个miniSTR复合扩增体系同步扩增技术对miniDDD体系正向引物的5’端进行荧光标记，对miniDDV正向和反向引物的5’端分别采用荧光素和生物素进行标记，同步扩增两个体系，将亲和素连接于磁珠上，利用生物素与亲和素的高亲和力(1×10<'-5>)，使两个体系的PCR产物在磁场下得到有效分离。通过这种方法可对6个mini-STR基因座进行同步扩增，能节约检材，提高检测信息量。 (三)miniSTR复合扩增体系在降解：DNA模板中的应用取足量的腐败组织，酚．氯仿法抽提DNA，进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，对800bp、600bp、400bp、200bp的凝胶电泳DNA片段进行回收，应用实时定量PCR仪进行定量后比较miniSTR与商品化STR试剂盒对降解DNA的检测能力。结果显示miniSTR体系可对200bp的降解片段进行成功分型。结论本研究建立的miniSTR复合扩增体系特异性好，灵敏度高，具有良好的数据库兼容性，能有效进行降解DNA样品的STR分型，有良好的法医学应用前景。
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