摘要
本工作通过对拟南芥T-DNA插入突变体库的筛选，得剑一个对细胞分裂素反应异常和根失去向地性的突变体 ckrc1 (Cytokinin induced Root Curling1)。遗传分析证明ckrc1是隐性纯合体。基因克隆和序列分析结果表明该突变基因编码一蒜氨酸酶类似蛋白。蒜氨酸酶是葱蒜类蔬菜含量非常丰富的蛋白，其生化反应及组织定位已经比较清楚。但是，在拟南芥中同源基因的功能尚未见报道。本文对ckrc1的表型作了较深入的研究。 在含细胞分裂素的MS培养基上，ckrc1 的根生长明显比野生型根长。在含有TDZ的培养基上做组织培养时，ckrc1 愈伤组织形成的速率、数量以及外植体愈伤诱导率都明显低于wt。以上结果表明 ckrc1 对细胞分裂素敏感性下降。其原因可能是i，ckrc1 中细胞分裂素信号转导过程受到影响，使得 ckrc1 对细胞分裂素不敏感；ii，外源细胞分裂素引起野生型和ckrc1 的内源生长素的水平下降，但是野生型下降程度更明显。在含IAA或TIBA的培养基上ckrc1 的表型与野生型一致。 在MS基本培养基上培养7天后转移到含细胞分裂素或TIBA的培养基上继续培养4大，ckrc1 根卷曲生长，卷曲的方向是随机的，而野生型的根垂直生长。在向地性实验中，野生型根很快向下弯曲生长，而 ckrc1 根的生长方向随机，这说明 ckrc1 根向地性很弱。等位突变体ckrc2和ckrc3的表型与ckrc1一致。ckrc1根卷曲生长和向地性很弱的机理可能是生长素极性运输受到了抑制。生长素的极性运输需要输入载体和输出载体两类蛋白协同作用。ckrc1 向地性反应可被自由透过细胞膜的生长素NAA弥补，说明其内源IAA很可能在进入细胞这一环节上受到抑制。虽然ckrc1根的向地性很弱，但是其花序茎的背地性却没有发生改变，其原理大概是因为花序茎的重力感受位点分布在整个伸长区的内皮细胞，不需要信号(生长素)的长途传递。另外，semi-qPCR结果表明，CKRC基因在根中表达最高，而在茎中表达非常弱，说明CKRC蛋白在茎中的生理作刚远没有在根中重要，也许它在茎中的突变不足以引起背地性反应减弱。 在MS培养基上培养12天，野生型生长较快，其根和下胚轴都比ckrc1的长。然而转移到土壤中培养后，二者在营养生长期生长状况没有区别，但是ckrc1开花期要迟一周左右。 在MS基本培养基上生长5天的wt幼苗根尖从OC到根冠最外层有六层细胞，而ckrc1只有五层，伸长区细胞分裂较慢而分化较快，造成细胞数量少，体积大，伸长区较短。ckrc1根尖髓部较窄，占根尖比例较小。 半定量RT-PCR证明CKRC在根中表达量最高，其次是花，再次是叶子，在花序茎和角果中表达最少，这与genevestigator网站公布的基冈芯片测定结果基本一致。 经IAA和ZT处理以后，生长素调节基因IAA1和IAA2和细胞分裂素调节基因ARR5和ARR15表达水平都有明显的升高，其升高程度在野生型和ckrc1之间没有明显区别。 本实验还构建了cDNA<,CKRC>-pBI121、全长 CKRC-pCAMBIA1300、启动子P<,CKRC>-pBI121三个载体，并都得到了转化植株。cDNA<,CKRC>-pBI121转化ckrc2的T2代约有1/4幼苗根生长速度比野生型快，向地性恢复。全长CKRC-pCAMBIA1300转化的T1幼苗向地性也得到恢复。P<,CKRC>-pBI121转化的幼苗正在收获T2代种子。
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