摘要
牙周病是人类最常见的口腔疾病之一，也是导致成人失牙的最主要的原因。牙周治疗理想的目标就在于诱导牙周组织再生，重建新生的牙周膜、牙槽骨和牙骨质，恢复牙周组织的结构和功能。目前牙周病的治疗尚不能从根本上实现这一目标。组织工程是一个以细胞生物学、发育生物学和生物材料学为基础，采用发育的方法，以新组织替代损伤组织的新兴科学领域。随着组织工程向牙周相关领域渗透，给牙周病的治疗开辟了新的思路。 组织工程的三大要素是：具有增殖分化潜能的种子细胞、细胞外基质材料、生长因子的作用。如何将种子细胞复合生长因子后植入细胞外基质材料，实现三者有效地统一，发挥功能是当前研究较多的内容。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是最常用的应用于诱导牙周组织再生的生长因子。如采用基因工程的方法，将BMP基因导入种子细胞，置于细胞外基质替代材料(即支架)后植入牙周骨缺损部位，使之在局部分泌BMP生长因子，可有效地实现牙周组织再生的目标。 支架材料是种子细胞的生长土壤，现在组织工程学者关注的是天然支架的开发。壳聚糖是从甲壳类动物外壳中提取出来的直链纯天然多糖，也是自然界唯一具有弱阳离子型电解质的新型生物医用材料。壳聚糖结构中含有与细胞外基质主要成分糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)共有的N-乙酰葡聚胺组分。壳聚糖容易被溶菌酶降解，具有广谱抗菌性，其良好的塑形性及可加工性，可被加工成任意形状。壳聚糖有良好的成膜性，成膜后具有很好的均一性和较高的机械强度，具有成为一种支架的可能性。但将转基因细胞与壳聚糖等生物材料复合，国内外研究甚少。本实验将转染hBMP2基因的NIH3T3细胞接种壳聚糖膜支架，采用细胞生长增殖实验、成骨活性测定等检测转基因细胞与壳聚糖的生物相容性，初步探察其在牙周组织工程的意义。 第一部分 壳聚糖膜的制备及性能检测 目的：制备适合细胞培养的壳聚糖膜，并检测其吸水率与体外降解率。 方法：将壳聚糖粉溶于1.5％乙酸，制成2％的浓度，采用流延法倾注于圆形盖玻片上，直径与24孔培养板孔径一致，烘干后成膜。测试2％壳聚糖膜的吸水率与体外降解率。 结果：壳聚糖膜表面平整，与盖玻片附着紧密，无卷边现象。2％壳聚糖膜的吸水率均值为106.5％，壳聚糖膜的降解速度明显慢于实验组，60d重量仅丧失了17.8％。在含溶菌酶的降解液中降解速度较快：10d时，重量丧失达8.8％；30d时，重量丧失达30％左右；40d时，重量丧失约一半左右；60d时已基本降解完全。 结论：壳聚糖具有良好的成膜性和润湿性。在溶菌酶中，壳聚糖膜具有较快的降解速度。 第二部分 壳聚糖膜对转染hBMP 2基因的NIH3T3细胞增殖活性的影响 目的：探讨转基因细胞在壳聚糖膜上粘附、生长和增殖情况。 方法：首先作转基因细胞的生长曲线，然后将转基因细胞消化后，种植于壳聚糖膜表面，以盖玻片为对照，6h后检测初始粘附率，2、4、6d时在倒置光学显微镜、扫描电镜下，观察细胞的粘附和生长情况，用MTT增殖实验检测增殖情况。 结果：NIH3T3细胞在转入基因后，增殖能力略有降低。6h初始粘附率实验组高于对照组。壳聚糖膜能够促进转基因细胞在其表面的粘附和形态保持，增殖指数增高(P<0.05)。 结论：壳聚糖膜支持转基因细胞的粘附、生长和增殖。 第三部分 壳聚糖膜对转染hBMP2基因的NIH3T3细胞碱性磷酸酶活性的影响 目的：观察壳聚糖膜对转基因细胞成骨分化能力的影响。 方法：将转基因细胞消化后，种植于壳聚糖膜表面，以盖玻片为对照组，2、4、6天时将其消化，分别取2×10<'4>、4×10<'4>、6×10<'4>个细胞行碱性磷酸酶活性检测。 结果：与对照组相比，实验组碱性磷酸酶无显著差异(P>0.05)。 结论：壳聚糖膜不抑制转基因细胞的成骨分化，保留其分化能力。
NETL