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IL-12p35沉默的树突状细胞延长大鼠移植小肠的存活时间
徐皓1
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摘要
第本研究分为五部分： 第一章 大鼠骨髓来源树突状细胞的培养、扩增与鉴定 目的：探讨体外诱导和扩增大鼠树突状细胞(DC)的方法，获得大量高纯度的树突状细胞，并从形态学和免疫学表型等方面给予鉴定。 方法：采用改良的Son培养方法，梯度离心提取骨髓单核细胞中的非粘附细胞，加入GM-CSF 5ng/ml、IL-4 5ng/ml进行诱导扩增，用显微镜观察形态学变化，电镜观察，流式细胞学检测细胞表面分子，以及功能学鉴定。 结果：DC前体细胞培养7d呈典型树突状结构，流式细胞学检查发现细胞表面均表达MHC Ⅱ、OX62和CD80。培养所得DC具有诱发混合淋巴细胞反应的能力，且成熟的DC诱发混合淋巴细胞反应更强。 结论：改良的Son法为体外诱导扩增大鼠骨髓来源．DC的有效方法。 第二章 IL-12 p35沉默对大鼠骨髓源性DC免疫功能的影响 目的:研究IL-12 p35 siRNA干涉对大鼠髓源性树突状细胞(DC)免疫功能的影响。 方法：通过粒细胞一巨噬细胞型集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和脂多糖(LPS)体外培养体系，从大鼠骨髓中获得DC，化学合成小型干扰RNA(siRNA)，体外转染DC。DC细胞表面分子CD80和MHC Ⅱ表达采用流式细胞仪分析，检测IL-12 p35转录采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，检测IL-12、IL-10分泌采用ELISA法，细胞免疫学功能采用混合淋巴细胞反应(MLR)检测。 结果：IL-12 p35 siRNA转染后的DC表面分子CD80和MHC Ⅱ表达无明显改变，分泌IL-12减少、分泌IL-10增多，刺激同种T淋巴细胞增殖的能力下降。 结论：IL-12 p35 siRNA的转染不能干扰DC的成熟，但可以抑制其免疫应答功能。 第三章IL-12 p35沉默的DC通过T细胞JAK-STAT途径阻断 IL-12信号调节免疫反应 目的：研究IL-12 p35沉默的DC是否通过JAK-STAT途径阻断IL-12信号，调节T细胞的活性。 方法:在DC与同种T淋巴细胞共培养30min后，检测T淋巴细胞 STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化水平。 结果:IL-12未沉默的DC与T淋巴细胞共培养后，STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化明显增加、IL-12 p35沉默DC与T淋巴细胞共培养后，STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化水平明显低于IL-12未沉默的DC。 结论: IL-12 p35沉默的DC可能是通过的JAK-STAT途径阻断T淋巴细胞激活。 第四章 大鼠小肠移植模型的建立 目的:建立稳定的大鼠节段性小肠移植模型。 方法:选用封闭群SD大鼠进行同种异体节段性小肠移植。带肠系膜上动脉的腹主动脉和受体肾下腹主动脉端侧吻合，供体门静脉和受体肾下下腔静脉端侧吻合。肠道重建：将供肠近端闭合，远端施出腹壁造瘘。 结果:进行了45次正式实验，6只于术后5天内死亡，死亡原因为低血容量性休克3只，静脉吻合口狭窄或血栓形成2只，造瘘口回缩1只。其余39只存活超过5天，占86.7％。最长存活超过120天。供体平均手术时间(60±10)min，受体平均手术时间为(90±15)min，其中动脉吻合(10±3)min，静脉吻合(15±5)min。移植肠热缺血时间(28±5)min，冷缺血时间(25±5)min以内。整个手术时间为(150±20)min。 结论:该种小肠移植手术方法成功率高，为小肠移植实验研究提供了稳定的模型。 第五章 IL-12 p35 siRNA转染的DC延长大鼠移植小肠存活时间 目的:探讨IL-12 p35 siRNA转染的供者树突状细胞(DC)延长大鼠移植小肠存活时间的作用。 方法:大鼠随机分为5组，每组8对，Wistar大鼠的小肠移植入SD大鼠。组Ⅰ：对照组，受体小肠移植术前7天腹腔注射生理盐水；组Ⅱ：移植前7天受体经腹腔注射未转染的供体DC；组Ⅲ：移植前7天受体经腹腔注射IL-12 p35 siRNA转染的供体DC。组IV：移植前7天受体经腹腔注射IL-12 p35 siRNA转染的供体DC，受体大鼠移植术后当天静脉注射CsA 8 mg/kg/d；组V：移植前7天受体经腹腔注射IL-12 p35 siRNA转染的供体DC，受体大鼠移植术后当天静脉注射CsA 20 mg/kg/d。观察受鼠移植小肠的存活时间，对移植小肠进行组织病理学检查，用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测受鼠血清白细胞介素2(IL-2)、γ干扰素(INF-γ)水平。 结果:组Ⅲ移植小肠存活时间较组Ⅰ和组Ⅱ有显著延长(P<0.05)，移植小肠组织组织病理损伤，较组Ⅰ和组Ⅱ明显减轻，血清IL-2和INF-γ显著低于组Ⅰ和组Ⅱ(P<0.05)。其中组Ⅳ的移植物存活时间最长、组织病理损伤最轻。 结论:术前经IL-12 p35 siRNA转染的DC可抑制大鼠小肠移植后的排斥反应，延长移植小肠的存活时间。加用小剂量的CsA后，其作用更明显。
关键词
树突状细胞/分离纯化/RNA干涉/白细胞介素-12/白细胞介素-10/细胞信号/小肠移植/器官移植/环孢菌素A/存活时间引用本文复制引用
授予学位
博士学科专业
外科学导师
吴文溪学位年度
2007学位授予单位
南京医科大学语种
中文中图分类号
R6