摘要
目的： 分析两个常染色体显性视网膜色素变性(autosomal dominant retinitispigmentosa，adRP)家系AA、AB 的临床表型特征并研究其遗传学病因。通过全基因组连锁分析首先进行家系疾病的遗传学定位，然后在连锁区内进行候选基因突变筛查。 1．研究两个adRP家系 AA、AB 的临床表型特征。 2．通过全基因组扫描连锁分析确定两个adRP家系致病基因的染色体定位。 3．通过基因序列分析对连锁区内一系列可能的候选基因进行突变筛查，寻找致病基因。 4．通过新技术多重连接依赖探针扩增(Mutiplex Ligation-Dependent ProbeAmplication，MLPA)反应和单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNPs)检测对RP11连锁家系AB进行候选基因PRPF31基因巨大缺失突变筛查。 研究方法： 1．临床研究方法： 1.1 眼科常规检查包括询问病史，屈光状态、眼前节裂隙灯检查，直接和间接眼底镜检查以及眼底照相等。 1.2 特殊检查方法包括视野检查(Htumphrey 750)，明、暗适应视网膜电图(electroretinogram，ERG)以及多焦视网膜电图(multifocal ERG)检查等。 2. 分子遗传学研究方法： 2.1 取家系成员外周静脉血5～8ml，采用Roche Biochemical公司的DNA分离试剂盒提取基因组DNA。 2.2 遗传连锁分析 2.2.1．全基因组扫描连锁分析在全部常染色体范围内选取370对荧光微卫星标记物进行全基因组扫描，相邻微卫星标记物之间的平均距离为10厘摩(Centimorgan，cM)。利用聚合酶链反应(Polymerase Chmn Reaction，PCR)扩增全部370对荧光微卫星标记物。利用 ABI 377XL DNA 测序仪读取370对微卫星标记物等位基因片段大小并利用 Genescan 3.1 和 Genotyper 2.0 软件进行单体型分析。运用SimWalk2 2.89，Version 3.35 软件计算计算疾病表型与多个微卫星位点之间的多点最大优势对数LOD值。 2.2.2 精确连锁定位在通过全基因组连锁分析取得疾病基因在染色体上的初步定位以后，在取得最大正数LOD值的初步定位区域内进一步选取荧光标记微卫星标记物，以缩小并精确连锁区域临界范围。标记物之间的平均距离为1cM。 2.3 基因序列分析根据连锁分析的结果，分别在AA和AB两个家系所定位的染色体候选区内选取侯选基因，并用 ABI 3730 Genetic Analyzer对侯选基因进行直接基因序列分析。 2.4 PRPF31 基因的巨大突变筛查在AB家系中对PRPF31 基因进行SNPs和MLPA检测以筛查潜在的巨大基因缺失突变即基因半合子状态(hemizygousity)。 研究结果： 1.AA 家系 临床上，AA 家系中的患者以夜盲起病，发病年龄较晚，表现为进行性视力下降和周边视野缺损。RP 临床表现在家系患者之间甚至同一患者的双眼之间均具有较大的变异，致病基因外显不全。通过全基因组连锁分析在排除了所有已知adRP连锁位点之后，在2号染色体长臂上确定了一个新的adRP连锁位点RP33(OMIM％610395)。在微卫星标记物 D2S2222取得最大多点LOD值4.69，通过家系中的两个正常同胞身上发生的重组(recombinant)可将RP33 位点定位于微卫星标记 D2S2159和D2S1343 之间约 4.8cM 的区域(染色体带 2cen-q12.1)内。 对RP33区域中的候选基因SEMA4C, CNGA3和HNKlST以及紧邻RP33区域的一个已知arRP相关基因MERTK进行序列分析未发现任何致病突变。 2．AB家系 AB 家系在临床上属弥漫型RP表型且具有较高外显率。此外，家系中有13名患者还同时具有皮质型白内障表型。 通过全基因组连锁分析和进一步的精确定位将此家系致病基因定位于染色体区19q13.4(RP11)(OMIM #600138)，微卫星标记物D19S924．和D19S880之间约5.71cM区域内。 对连锁区内的已知adRP基因 PRPF31 进行完整的突变筛查基本排除了PRPF31 全部阅读框架范围内的突变。进一步在连锁区域内选取其它候选基因PRKCG、TFPT、TSEN34、RDH13 和 U2AF2 进行直接测序未发现致病性突变。 结论： 1．AA和AB家系属于常染色体显性遗传视网膜色素变性家系。 2．通过AA家系定位了一个新的adRP连锁位点RP33于染色体区域2cen-q12.1，这是首个由中国报道的RP新位点。SEMA4C、CNGA3、HNKlST和MERTK基因均不是AA家系的致病基因，在RP33区域内存在的新adRP致病基因还有待发现。 3．AB 家系连锁于染色体区域19q13.4(RP11 位点)。RP11 基因PRPF31不是AB家系的致病基因。在连锁区域19q13.4内，除了PRPF31基因之外，推测还存在另一个新的adRP相关致病基因导致了AB家系中弥漫型RP表现且可能还合并有外显不全的白内障表型。
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