核糖体失活蛋白（RIPs）基因的克隆及其对甜菜遗传转化的研究

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中文摘要：甜菜是世界上重要的糖料作物，但生产中甜菜病害较多，其产量和品质受到严重威胁。改变植物性状表现，转基因是最直接有效的手段。近年来，人们开始尝试通过遗传转化有目的地将抗病基因导入甜菜品种，从中选育抗病、丰产、优质的甜菜新品种。虽然国内外这方面的研究较多，但所取得的成效却甚微，其主要原因是甜菜再生较为困难，遗传转化体系基因依赖性强。植物遗传转化方法有很多，农杆菌介导法由于其可以转入的片段长，拷贝数少，遗传稳定性好等优点，一直是科学研究者重点研究的方法。前人的研究结果表明，核糖体失活蛋白(RIPs)具有抗病毒、真菌、细菌等多种抗性。本研究是通过PCR法，将玉米(Zea mays)RIPs基因克隆出来，构建重组质粒，利用农杆菌法将目的基因导入甜菜，并在已建立的甜菜再生体系基础上，对农杆菌介导的转化条件进行了优化，建立了稳定的甜菜子叶节遗传转化体系，获得转RIPs基因的甜菜植株，为甜菜抗病分子育种提供了基础材料和理论依据。目前取得的主要研究结果如下： 1、利用PCR方法从玉米幼苗叶片总DNA中克隆到RIPs基因，并进行序列测定。该基因全长953bp,与文献报道的核苷酸序列具有99.90％的同源性，氨基酸同源性为100％； 2、通过pMD18-T Vector 这一克隆载体的介导，将RIPs基因与质粒pCAMBIA2301相连，构建了以CaMV35S为启动子，以Tnos为终止子的植物双元表达载体，该载体含有npt Ⅱ选择标记基因。 3、优化了农杆菌介导的甜菜子叶节遗传转化体系，结果显示：将对数生长期的农杆菌重悬稀释后调浓度OD<,600>值为0.4，子叶节外植体经过24h预培养，侵染时间8min，共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮，22℃～25℃共培养48～60h，经过Cb抑菌和125mg/L的Kan筛选，有利于甜菜子叶节的遗传转化。可得到最高的抗性芽率。 4、用液氮冷冻法将重组质粒转入农杆菌LBA4404，实现了核糖体失活蛋白(RIPs)基因对甜菜的遗传转化，共获得抗性植株38株，PCR检测的阳性植株11株，阳性植株比率为28.9％。

作者：

孙亚卿

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关键词：

抗病分子育种核糖体失活蛋白基因克隆甜菜遗传转化

授予学位：

博士

学科专业：

植物学

导师：

张少英、邵金旺

学位年度：

2007

学位授予单位：

内蒙古农业大学

语种：

中文

中图分类号：