摘要
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal protein,Vip)是1996年Estruch等首先发现的，在营养期表达并分泌到培养基中的一种杀虫蛋白。Vip3A对鳞翅目(Lepidoptera)昆虫具有广谱高效的杀虫活力。序列分析其与已知的杀虫晶体蛋白没有任何同源性，并且杀虫机制不一样，因此Vip3A是一种新的杀虫蛋白，研究它对于我们扩宽Bt杀虫谱，延缓昆虫抗性具有重要意义。本研究对实验室的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白开展了一系列的研究，结果如下： 1．对实验室不同亚种的苏云金芽孢杆菌进行vip3A 类基因的检测，克隆表达了 Bt4.0718 中vip3A 并进行了生物活性测定和纯化。 根据已发表的vip3A保守区设计了一对引物对实验室存在的苏云金芽孢杆菌拟步甲亚种(Bt subsp.tenebrionis)、以色列亚种(Btsubsp.israelensis)、武汉亚种(Bt subsp.Wuhanensis)、库斯塔克亚种(Btsubsp.kurstakf)进行了PCR检测，发现除我室选育的Bt 4,0718能够扩增出特异条带，其他菌株均没有出现阳性信号。将Bt 4.0718扩增出的目的片段TA克隆并测序，并与其它vip3A序列比对，结果表明此片段为vip3A类基因，因此确定Bt 4.0718带有营养期杀虫蛋白基因。此基因已在NCBI上进行了登录(登录号为DQ497637)。结合我室曾经做过的Bt 4.0718 发酵上清生测结果研究，Bt 4.0718发酵上清对小菜蛾(Plutella xylostella)具有很好的毒力，根据本研究检测结果，推测vip3A蛋白的表达分泌是Bt 4.0718的发酵培养液上清具有杀虫毒力的原因之一。 将扩增出的vip-Bt4的开放阅读框与pET28a载体连接转化到大肠杆菌BL21中表达，SDS-PAGE 进行检测，1mol/L IPTG诱导1h即出现了目的带。将表达的蛋白用 AKTA purifier His-Tag 亲和层析柱进行纯化得到了单一的目的条带。用纯化得到的Vip3A对家兔进行免疫，得到了Vip3A的抗体。以诱导4h的BEVB的发酵菌体进行室内杀虫生物活性测定，得到其对甜菜夜蛾(Spodoptra exigua)的半致死剂量为0．9851mg/ml，96h 致死率为94．8％。对棉铃虫(Helioths vitesces)的半致死剂量为1．5 mg/ml，96h 致死率为69．44％，毒力效果明显。 2．利用绿色荧光蛋白基因egfp检测营养期杀虫蛋白的表达及Vip3A与芽孢效应的关系 本研究构建了绿色荧光蛋白基因egfp与营养期杀虫蛋白融合表达载体 pHTVG。将两基因共同置于vip3A的启动子之下，插入穿梭载体pHT315，转化入无晶体突变株CryB得到BHTVG。SDS-PAGE和 Western-blotting显示在110kDa 处检测到有表达的融合蛋白带。同时16h重组菌体在荧光显微镜下可以检测到绿色荧光，并且随着时间的推移，荧光有所增强。 提取培养72h的工程菌的芽孢，并进行荧光检测，没有检测到荧光，说明营养期杀虫蛋白不构成芽孢的组成。推测营养期杀虫蛋白参与芽孢效应是通过昆虫吞食芽孢和晶体，芽孢进入到昆虫中肠，生长成菌体，并开始表达Vip3A，和Cry类蛋白一起发挥作用，破坏中肠，最终导致昆虫死亡。
NETL