摘要
柴胡始载于《神农本草经》，为常用中药。中国药典2005年版收载北柴胡和红柴胡(狭叶柴胡)两种。但据文献记载和实地调查，柴胡属植物的绝大多数种类在产地均作药用柴胡，并且在生长地常常有数种柴胡混杂生长。由于药用柴胡使用品种混乱，化学成分复杂，有效成分含量相差悬殊，造成柴胡及其制品质量的不稳定。柴胡为河北省道地药材，主要分布有北柴胡、烟台柴胡、百花山柴胡、兴安柴胡、红柴胡、黑柴胡等，另外，三岛柴胡在该省大面积种植栽培。本实验利用传统的鉴别方法如性状、显微、理化鉴别并采用细胞生物学、分子生物学等现代分析技术对柴胡属种子进行综合的鉴别研究。从而为鉴别柴胡属种子的物种提供科学依据；同时对柴胡GAP生产的实施，保证种质资源的稳定性、可控性具有指导意义，为规模化、规范化种植提供可靠的依据。本实验方法快速、简便、实用，能满足基层需要，为柴胡种子的品种鉴定、开发和应用奠定了科学基础。 第一部分性状、显微、理化鉴别 目的：应用快速、简便、实用的方法，建立柴胡种子的外观性状、显微特征、理化性质方面的综合鉴别信息指征。 方法： 1.外观性状观察。 2.脱色表面片制备：(1)脱色：拨取种皮切成1～2 mm小块浸入水合氯醛(1∶1)水溶液中。(2)压片观察。 3.石蜡横切片制备：(1)取材和固定：种子用蒸馏水4℃浸泡一周以上，F．A．A固定液固定两周以上。(2)脱水：依次用浓度为70％、80％、90％、95％的乙醇溶液、无水乙醇进行脱水，每隔2～3 h调换溶液。(3)透明：二甲苯：无水乙醇(1∶1)浸种1 h后，转入二甲苯中至种子透明为止。(4)浸蜡：65℃恒温箱中进行，半小时调蜡一次，至种子完全浸透。(5)包埋和切片：石蜡包埋，切片厚度12μm。(6)贴片和熔蜡。(7)染色：番红－固绿双重染色。(8)脱水与封藏。 4.种皮扫描电镜观察：(1)清洗：取种子用50％乙醇超声清洗5 min。(2)脱水：50％、60％、70％、80％、90％、100％乙醇逐级脱水，每一级脱水两次，每次30 min，其间不断震荡清洗。(3)固定：戊二醛固定30 min。(4)电镜观察：真空喷金后，进行观察。 5.紫外扫描图谱特征：(1)取适量柴胡种子粉末用不同极性的赢剂，依次为石油醚、乙酸乙酯、无水甲醇，索氏提取3 h，分别制备供试液A、B、C。(2)扫描波长为200～400 nm的紫外吸收图谱。(3)图谱分析。 6.薄层色谱鉴别：(1)分别将供试液A、B浓缩，供点样：(2)点样，展开。(3)显色、观察、照相。结论：柴胡属不同种植物的种子在外观性状、显微特征、理化性质存在差异，由此可以用于鉴别。方法快速、简便、实用，适用于几种柴胡种子的快速鉴别。 第二部分细胞生物学及分子生物学特征研究 目的：利用染色体组型分析、种子蛋白质 PAGE、SDS-PAGE技术及RAPD技术研究几种柴胡种间的综合鉴别信息指征，从细胞水平及分子水平鉴别真伪，并为柴胡种子的品种筛选提供依据。 方法： 1.根尖体细胞染色体标本片制备：(1)预处理：挑选饱满的种子，于25℃下萌发，待根尖长到1.0～2.0 cm时，切取约2 mm的根尖于蒸馏水中4℃低温处理24 h。(2)固定：卡诺固定液(无水乙醇：冰醋酸=3∶1)固定1.0～1.5 h。(3)解离：95％乙醇：浓盐酸解(1∶1)离8～15 min。(4)后低渗：重蒸水低渗，时间10～15 min。(5)染色：改良石炭酸品红液染色。(6)封片：冰冻后揭去盖片，中性树胶封片。(7)显微照相、计数、测量。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱特征研究：(1)制备供试品溶液。(2)制备分离胶和浓缩胶。(3)电泳：恒定电压120～180 V。(4)染色和洗脱：考马斯亮蓝(R-250)染色，脱色液洗脱至背景清晰为止。(5)结果分析：绘图并测定特征谱带的泳动率。 3.RAPD技术鉴别：(1)高盐低pH法提取纯化植物总DNA。(2)PCR扩增及引物筛选。(3)图谱分析。 结论：应用生物学技术对柴胡种子进行鉴别研究，可以较根本的揭示柴胡属种间的差异，为柴胡种源筛选提供依据。
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