摘要
血源不足和血液污染是长期困扰临床输血治疗的难题。由于艾滋病、肝炎等传染性疾病的出现和流行，使这两大问题越来越严峻，研究人血液代用品的任务也越来越紧迫，但是血液代用品尤其是红细胞代用品的研究至今仍没有取得显著进展。人/动物造血嵌合体的构建向制造人类血液提供了一种崭新的思路和可行的手段。人/动物造血嵌合体即在放射清髓或新生动物体内行人造血干细胞(human hematopoietic stem cell，hHSC)移植后所形成的嵌合体，人HSC可以在嵌合体动物体内定居、增殖及分化。理论上讲，嵌合体动物将部分或全部由人HSC发挥造血功能'其部分或全部血细胞是由人HSC分化发育而来，与从人体采集的血细胞具有完全相同的基因起源、细胞表型和生物学功能，是替代人类血液的理想来源。 猪器官大小及免疫学、生理学特性与人类具有相似性，因此成为公认的最佳异种器官来源。利用新生乳猪免疫系统未发育完全的特性，行人造血干细胞移植可规避人/猪造血嵌合体(human-to-SWine hematopoietic chimera，human-swine HC)形成和稳定所受到的免疫学屏障制约。但在异种移植中供者造血干细胞在受者体内向骨髓和胸腺迁移、分化、活化等过程与供受者间细胞因子、黏附分子及其受体相互作用有关，供者干细胞表面的细胞因子、黏附分子受体是否可与受者相应配体结合，取决于分子间有无严格的种属限制性，即分子不相容性。这种不相容性可能影响人/猪造血嵌合体的形成和稳定。本试验旨在用新生乳猪构建人/猪造血嵌合体，初步研究、探讨人脐血HSC在体外猪造血微环境模型和嵌合体猪体内分化过程中关键造血因子的分子不相容性。 本文的主要研究内容及结果包括： 1、将小型猪骨髓、肾上腺、肾、脾、肝和骨骼肌等六种组织分别进行原代培养，于不同时相点收集浸出液，用定量ELISA法检测六种组织原代培养浸出液中猪关键造血因子-干细胞因子(SCF)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)的表达水平，结果表明：5h肾组织培养液中五种造血因子浓度均明显高于相同时相点其它组织培养液(P<0.01)，且各时相点中第24h培养肾浸出液因子浓度为最高；故采用低温高渗浓缩技术将培养24h肾组织浸出液用于制备猪关键造血因子复合物。 2、采集健康人、小型猪骨髓经密度梯度离心分离单个核细胞，接种于专用培养基，经贴壁分离培养骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)，将贴壁细胞层辐照后分别模拟人、猪造血微环境；利用免疫磁珠分选技术(Magnetic activated cellsorting，MACS)分选人脐血CD34<'+>细胞。采用红系半固体培养体系和红系液体培养体系比较研究人/猪源性关键造血因子对人脐血CD34<'+>细胞向红系分化的影响；采用模拟微环境体系比较研究体外人/猪造血微环境对人红系祖细胞晚期分化的影响。红系半固体培养体系结果显示：人、猪源混合因子组CFU-E显著低于人源因子组(P<0.01)；红系液体培养体系结果显示：人源因子组细胞扩增倍数和诱导分化效率均显著高于人、猪源混合因子组(P<0.01)；结果表明人/猪源性关键造血因子存在分子不相容性；模拟微环境体系结果表明体外猪造血微环境在人EPO作用下对人红系祖细胞的分化促进作用为体外人造血微环境的80％左右，能够提供对人红系祖细胞向晚期分化的支持。 3、将人脐血CD34<'+>细胞(5×10<'5>/Kg)经腹腔注射移植入新生乳猪体内，构建人/猪造血嵌合体，以连续腹腔注射人SCF(50ng/Kg.3d)、EPO(100U/Kg.3d)和不注射人源因子为条件分为两组，比较研究人/猪关键造血因子在嵌合体内对人脐血CD34<'+>细胞向红系分化的影响。于移植10 d，20 d，30 d，40 d，50 d，60 d后经上腔静脉取小型猪外周血，流式细胞仪检测外周血中人源性CD71<'+>细胞(红系细胞)比例，以同龄正常小型猪外周血为阴性对照；同时，进行嵌合体猪抗人种属抗体检测。结果表明，实验猪均正常生长、发育，无感染、死亡。流式细胞仪检测结果为：注射因子组嵌合体猪外周血人源性CD71<'+>细胞比例明显高于非注射组(P<0.01)，表明体内猪源因子不能支持人脐血CD34<'+>细胞向红系分化，人/猪源性关键造血因子存在分子不相容性。猪抗人种属抗体检测结果为：正常小型猪于16d龄出现针对人源性细胞的种属抗体；而嵌合体猪则在50d龄开始出现，抗体效价明显低于同龄正常猪，表明给新生乳猪移植人脐血造血干细胞能够诱导人/猪造血嵌合体和免疫耐受的初步形成。 脐血中的造血干细胞免疫原性低且来源丰富，是一种具有广泛应用前景的干细胞。新生乳猪免疫系统发育不完善且基本能够模拟人各种生理过程，成为较理想的实验动物。我们的实验证明给新生乳猪移植人脐血造血干细胞诱导形成人/猪造血嵌合体和供者性免疫耐受是可行的，嵌合体猪外周血中人源红系细胞的出现表明人造血干/祖细胞能够在嵌合体内向红系分化和发育，初步实现了嵌合体供者型造血。因此，用新生乳猪可建立人/猪造血嵌合体模型，为进行人脐血造血干细胞在嵌合体内生物学特性研究和人源性造血研究提供实验支持。
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