摘要
目的：应用 RNA 干扰技术抑制血管内皮生长因子 (VEGF)表达，并通过体外实验，观察VEGF受抑制后，结肠癌细胞凋亡情况的变化，为RNA干扰技术的临床应用奠定基础。 方法：(1)将VEGF基因mRNA作为RNA干扰的靶区，通过E-RNAi网上提供的服务，设计两个特异的RNA干扰序列，将其装入含U6启动子的载体上，构建成抑制VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体。(2)体外实验中，将上述载体转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2，通过RT-PCR、免疫荧光、Northern blot和Western blot观察VEGF表达受抑的程度；通过Tunel、电镜和流式细胞计数的方法，观察VEGF受抑制后，肿瘤细胞凋亡发生率的变化。 结果：(1)成功构建了两种抗VEGF的shRNA表达载体，测序证实序列正确。(2)体外实验中，通过RT-PCR、免疫荧光、Northern blot和Western blot，发现这两种抗 VEGF 表达载体，在胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2细胞系中，能明显抑制 VEGF 基因的表达，但在不同的细胞系中，其抑制效率不同；Tunel、电镜和流式细胞计数分析显示，当 VEGF 受抑制后，肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。 结论：(1)针对VEGF基因的 shRNA 表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达，但在不同细胞系中的作用强度有明显差别，提示 RNA 干扰作用存在明显的细胞系选择性。(2)Tunel、电镜和流式细胞计数分析显示，当VEGF受抑制后，肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。
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