摘要
喜树(Camptotheca acuminata)为珙桐科(Nyssaceae)多年生落叶乔木，为我国特有树种。因其含有重要的抗癌活性物质一喜树碱而备受关注。本研究以喜树为研究对象，建立高效的组培再生体系，并在此基础上，利用农杆菌介导法将细胞分裂素生物合成限速酶一异戊烯基转移酶基因(枷)导入喜树体内，探索喜树遗传转化的技术参数．初步建立了喜树遗传转化体系，为利用基因工程技术对喜树进行遗传改良打下基础。其主要研究内容如下： 1．喜树高效再生体系的建立试验以喜树种子萌发生长5-20d的无菌种苗子叶和下胚轴为外植体．以WPM培养基为基本培养基，愈伤组织诱导和分化的最佳培养方式为先在WPM+6-BA1.5mg/L+NAA0.5mg/L培养基上诱导出不定芽，然后及时转入WPM+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L培养基上继续培养，愈伤组织诱导率和分化率最高可分别达到100％和77.8％。不定芽增殖和壮苗培养以WPM+6-BA0.5mg/L培养基最佳，增殖倍数可达11.2。最佳生根培养基为WPM+IBA0.5mg/L，生根率达98％。移栽时，以珍珠岩和田土1：1比例基质成活率最高，成活率可达83％。研究结果表明，培养基中加入0.1-0.2mg/L2,4-D可加快愈伤组织生长，但不利于愈伤分化，0.1-0.2mg/L的KT在不定芽增殖、壮苗和生根中均具有不利影响。 2．农杆菌介导的喜树遗传转化体系建立建立了以喜树子叶和下胚轴为转化受体的根癌农杆菌遗传转化体系，初步确定了抗生素卡那霉素(kan)的筛选浓度，子叶和下胚轴不定芽分化的有效卡那霉素(kan)筛选压分别为30mg/L和20mg/L，再生苗生根的kan筛选浓度为30mg/L。其次我们还将头抱霉素(cef)和特美汀(Timentin)两种抑菌剂对叶片分化不定芽的影响进行了比较实验．结果发现Timentin对不定芽分化的影响要小于头孢霉素(Cef)的影响，timentin浓度300mg/L时，子叶分化率达到42.8％，而cef在同样的浓度下子叶分化率为17.1％。timentin的抑菌效果也好于头孢霉素(Cef)。确定选择150mg/L的Timentin效果最佳。在遗传转化过程中，通过评价到得的抗性愈伤率，详细探讨了外植体预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间等影响因素对转化效率的影响。结果表明，选择喜树无菌种苗苗龄5-20d的子叶和下胚轴，预培养2d，菌液浓度在OD值0.5，浸染8-15min，共培养3d为最佳技术参数。对获得的喜树再生植株进行PCR检测，证实ipt基因已经整合到喜树基因组中。
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