酵母发酵生物质产生的生物乙醇是一种可再生的液体燃料，最有希望替代最终将被耗尽的化石能源，同时这也支持可持续发展。酿酒酵母被广泛应用于生物乙醇的发酵生产。在酿酒酵母中有五个基因ADH1-ADH5 编码与乙醇代谢相关联的乙醇脱氢酶，其中的四种乙醇脱氢酶Adhlp，Adh3p，Adh4p和Adh5p在葡萄糖发酵过程中将乙醛还原为乙醇，而Adh2p则催化相反的反应将乙醇氧化为乙醛。当外界环境中的葡萄糖被耗尽后Adh2p负责催化利用乙醇作为碳源的初始反应。为构建一株乙醇高产的酿酒酵母，尝试通过基因敲除手段敲除ADH2来阻断Adh2p催化的乙醇代谢支路通道来提高乙醇的产量。 分别从SGD和GenBank获得ADH2和pUG6质粒的序列，设计一对嵌合引物以及六条验征引物。其中上下游嵌合引物的5'末端分别由45个与ADH2上下游同源的核苷酸组成；3'端则分别由19和22个与pUG6质粒上的loxP-kanMX-loxP序列组件两端同源的核苷酸组成。验证引物A，D分别位于ADH2的上下游；B，C位于ADH2上；KB，KC则位于kanMX上。由嵌合引物通过扩增pUG6质粒中的loxP-kanMX-loxP序列组件产生ADH2基因敲除序列组件。将ADH2基因敲除序列组件转化至酵母细胞后，分别与ADH2序列上下游同源的45 bp序列将引发两次同源重组事件，最终以loxP-kanMX-loxP取代基因组中的ADH2并赋予转化子G418抗性。经菌落PCR 验证为阳性转化子后进一步转化携带可赋予抗生素Zeoin抗性的ble<'r>标记基因质粒pSH65并在含半乳糖的培养基中诱导pSH65表达Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组实现标记挽救。移除质粒pSH65后通过重复同样的步骤敲除另外一个ADH2等位基因后获得了一株ADH2基因敲除的纯合子菌株。
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