摘要
目的：构建Mtb复活促进因子B(RpfB)、D(RpfD)、E(RpfE)的原核表达质粒，并在E.coli中表达和纯化重组的Rpf样蛋白，初步探讨其对分枝杆菌生长的影响。 方法：以BCG基因组为模板，用PCR法扩增出RpfB(1089bp)、RpfD(465bp)和RpfE片段(519bp)，并分别连接在pET32a(+)载体上，重组质粒经酶切和DNA测序鉴定后，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达了RpfB、RpfD和RpfE蛋白；用免疫印迹法(Western-blot)鉴定重组蛋白后，采用Ni-NTA树脂亲和纯化目的蛋白。然后将三种重组蛋白分别添加到LB培养基中，利用三种不同的方法(划线法、涂布法、倾注法)接种MS，观察不同的重组蛋白对细菌生长的影响。最后，以BCG、Mtb H37Ra、海分枝杆菌为研究对象，将三种重组蛋白分别添加到L-J培养基中，通过观察菌落形成时间了解不同蛋白对细菌生长的影响。 结果：重组质粒经双酶切鉴定，片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致。重组蛋白经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现分别在61kDa、39kDa、41kDa处有特异性条带。用划线法、涂布法、或倾注法均可观察到LB培养基中到添加了任意一种重组蛋白都能加快MS的生长。将重组蛋白加入到L-J培养基中时，添加蛋白组与对照组比较无显著差异。 结论：成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-RpfB、pET32a(+)-RpfD、pET32a(+)-RpfE，并获得了3种具有生物学活性的重组蛋白，能促进MS的生长。未能观察到添加了Rpf样蛋白的L-J培养基有明显的促迟缓生长型分枝杆菌(BCG、Mtb H37Ra、海分枝杆菌)生长的作用。
NETL