摘要
该研究依据Shinriki等(1987)及彭朝晖(1991)报道的哺乳动物肝tRNA<'Ile>核苷酸序列,采用固相磷酰胺法,化学合成了大鼠肝tRNA<'Ile>基因.大鼠肝tRNA<'Ile>基因由77bp组成,为了便于克隆与转录,在其5'端添加合成了BamHI、SfiI酶切位点及T7RNA聚合酶启动子序列,3'端添加合成BstNI及HindⅢ酶切位点,合成基因全长120bp,被克隆到M13mp18载体中,经分子杂交、PCR酶切分析筛选出阳性克隆rec-M13mp18,序列分析证实与所设计的基因完全一致.采用PCR从rec-M13mp18中扩增出12bp的合成基因片段,经限制性内切酶BstNI酶切后作为模板,利用T7RNA聚合酶在体外转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNA<'Ile>基因,生成不含修饰碱基的tRNA<'Ile>.对体外转录反应条件进行了优化,tRNA产量可达模板量的40倍.经对体外转录片段大小及运用Northern blot鉴定,证明作者获得了大鼠肝tRNA<'Ile>.进一步,在大鼠肝无细胞系统中对转录产物的氨基酰活性进行了检测.结果表明:(1)每10D<,260>的无修饰核苷酸的体外转录产物可负载387pmol的Ile,其氨基酰化活性是天然tRNA<'Ile>的38.7%.提示修饰核苷酸可能参与哺乳动物IleRS对其相应tRNA<'Ile>的识别.(2)在精胺作用下,体外转录产物的负载活力可提高2倍,提示精胺对不含修饰核苷酸的哺乳动物tRNA<'Ile>的氨基酰化反应亦有一定的刺激作用.以pGEM-9zf(-)为载体构建了由T7启动子带动的大鼠肝tRNA<'Ile>合成基因的表达质粒pGWIW,将其转化至可编码T7 RNA聚合酶的宿主菌E.coli JM109(DE3)中,利用T7 RNA聚合酶/启动子系统的大肠杆菌体内表达大鼠肝tRNA<'Ile>,Northern blot检测到tRNA<'Ile>的表达.逐步经酚抽提、DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析及HPLC层析,分离纯化出tRNA<'Ile>.氨基酰化活性检测表明:分离纯化后,每一OD<,260>的大鼠肝tRNA<'Ile>可负载约650pmol的Ile,是对照组兔肝天然tRNA<'Ile>生物活性的65%,纯度为54.1%以上说明作者利用合成基因成功地在大肠杆菌体内表达出具有一定生物学活性的大鼠肝tRNA<'Ile>,为进行哺乳动物tRNA功能与构象的研究打下基础.
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