摘要
衰老的机理至今不明,有关衰老与基因表达及其调控研究较少.基因的转录在基因表达调控中是较重要的.本文通过建立的细胞核及染色质体外转录体系,研究了人胚肺成纤维细胞(2BS)细胞核及染色质的体外转录活性与代龄的关系,结果发现:1.衰老2BS(60±2代龄)细胞核体外转录活性较年轻2BS(28±2代龄)的下降33%(P<0.01).2.为探讨转录活性下降机理,我们又研究了转录起始能力和聚合酶的活性.发现衰老2BS细胞核的转录起始能力较年轻的下降44%(P<0.01).不与染色质结合的RNP一定浓度外源模板作用下,转录活性基本无差异(P<0.05),而与染色质结合的RNP转录活性则随增龄明显下降.3.从上述实验结果分析,决定年轻与衰老2BS转录活性差异的因素中,染色质似起重要作用,是否由于染色质上可供转录的"开放"基因随增龄而减少,我们采用了染色质体外转录体系和DNaseI敏感实验.结果显示,衰老2BS染色质体外转录活性较年轻2BS的下降58%(P<0.01).DnaseI消化动力学曲线可看出,衰老2BS染色质DNA消化率在各个时间点上,都明显低于年轻2BS,酶解电泳也证实这一点.基于上述结果,本实验又用EGF分别刺激衰老和年轻2BS细胞,通过核染色质DNA的DNaseI酶解电泳和DNaseI超敏感Southern印迹分析表明其结果完全支持了上述实验结果.衰老2BS细胞染色质DNA(包括c-fos基因)对DNaseI消化敏感性下降,故推测大多数基因被蛋白质封闭而处于"关闭"状态,这种封闭状态也可是DNA结合蛋白质的磷酸化、乙酰化、核糖基化,也可是DNA的甲基化等造成,或者是基因多位于染色质结构比较紧密的区域而导致开放的基因减少,进而导致转录活性下降.4.我们还分别测定了特异催化合成rRNA及mRNA的RNPI及RNPⅡ的转录活性.发现衰老2BS细胞核内RNPⅠ及RNPⅡ都较年轻2BS的有所下降,下降率分别是24%和38%(P<0.05,P<0.01),其中RNPⅡ转录活性下降最为明显.5.RNA合成后从细胞核转运到核外也是转录调控的重要部分.结果表明,衰老2BS细胞核内RNA被转出核外的量为总合成量的29%,明显低于年轻2BS的45%(P<0.01).综合实验结果提示,染色质结构的改变可能是衰老2BS细胞转录活性下降的原发原因.
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