摘要
内阿片肽作为一类重要的神经递质对神经、感觉、运动、免疫等系统的功能具有重要调节作用,尤其对痛的调节作用最为突出.为了研究激动剂诱导下DOR的磷酸化具体发生于 哪一个位点,作者首先构建了C末端区缺失六个丝/苏氨酸残基及三个丝/苏氨酸残基的DOR突变体△31张△15.在转染HEK293细胞48小时后,放射配体结合实验、免疫沉淀实验以及免疫荧光实验的结果都显示,受体C末端区的缺失不影响配体与受体的结合及受体的表达.在用 △31、△15或野生型受体转染HEK293细胞48小时后,作者采用<'32>Pi标记细胞,在DOR特异激动剂DPDPE刺激后,通过免疫沉淀富集受体,SDS-PAGE分离受体,最后通过磷屏扫描仪或 者X光片放射自显影,观察受体的磷酸化水平.许多数据提示:激动剂诱导的阿片受体磷酸 化是由GRK介导的,而PKA、PKC都不参与.作者的研究发现,GRK2的过量表达,使野生型受 体的磷酸化增加了150%,但却不能使突变体△31、△15及M3发生磷酸化.为了研究GRK介导的DOR磷酸化对受体介导的信号的调控作用,作者将GRK5和GRK2分别与DOR共表达在HEK293细胞中,GRK5和GRK2的表达显著地减弱了DOR介导的对细胞内腺苷酸环化酶活性的抑制作用,GRK2磷酸化立位点T358和S363的突变明显抑制了GRK2对受体反应性的这种调控作有,GRK2受 体相互作用位点TS361的改变也部分地抑制了GRK2的调控作用.S363的突变对GRK5的调控作 用影响较小,GRK5两个磷酸化位点T358或T361的突部分地抑制了GRK5对受体反应性的调控作用.
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