摘要
HSD-2.4是以不孕妇女血清先后筛选人睾丸λgt11表达文库和人睾丸cDNA文库所获得的人睾丸特异表达的基因.其开放阅读框架为2447bp,编码548个氨基酸.该论文工作在以往的基础上,对HSD-2.4的全长进行了扩增,得到其全长cDNA序列,命名为HSD-3.8.利用重叠区扩增基因拼接法成功获得了HSD-3.8编码区cDNA片段,为以后全面研究该基因奠定了基础.SMART和Prosite软件对该蛋白质进行结构域分析,确认HSD-3.8编码蛋白质具有糖基化位点、PKC磷酸化位点、CK-2磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、豆蔻酸化位点、酰胺化位点、ATP/GTP结合位点基序A(P-loop),以及三个TPR区,每个TPR区又分别由三个TPR基序构成.氨基酸同源分析发现HSD-3.8编码蛋白质与小鼠的TPIS具有较高的同源性.利用以往制备的抗HSD-0.7的多克隆抗体检测在人和大鼠睾丸中表达的HSD-3.8编码蛋白,结果发现在这两种组织中仅有一大小约为55~60kDa的蛋白质能与多克隆抗体特异反应,显示HSD-3.8及其同源基因所编码蛋白质在生理状态下约为55~60kDa.推测HSD-3.8编码蛋白质的功能正常发挥需要翻译水平或翻译后水平的修饰过程.我们选择了HSD-3.8编码蛋白质中与生育相关的片段:HSD-0.7和较长的含HSD-0.7的片段:HSD-1.4作为"诱饵"蛋白,利用酵母双杂交系统分别从人卵巢和人睾丸cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白质.为了验证HSD-3.8编码蛋白质和人G蛋白β1亚基的相互作用,并研究这种作用的生理意义,我们分别采用体外和体内体系.在大肠杆菌中分别表达并纯化"诱饵"蛋白:HSD-0.7和"捕获"蛋白:G蛋白β1亚基羧基端144个氨基酸.在体细胞中,我们探索了HSD-0.7对由Gβ1γ2引发的ERK2激活信号通路的影响.结果显示HSD-0.7片段对于Gβγ引发的ERK2活化过程具有一定的促进作用.为了验证HSD-3.8编码蛋白质和人TRAF4相关因子1的相互作用,我们首先在大肠杆菌中表达了人TRAF4相关因子1片段His-tagged-21<'#>,并用纯化的该融合蛋白制备了多克隆抗体.利用抗21<'#>免疫兔血清进行了人睾丸组织免疫组织化学研究.
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