摘要
该研究旨在采用分子生物学技术,构建一种具有较高耐热性的β-1,3—1,4—葡聚糖酶基因工程菌,利用其产生的酶制剂来提高大麦在饲料业和酿酒业中的应用价值. 试验以筛选得到的具有较高耐热性的菌株——蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus, BC-10)作为出发菌株,参考GenBank上登录的其它来源的β-1,3—1,4—葡聚糖酶基因序列,分析其同源性,并根据其保守区设计2对引物,即5'端引物5PA1、3PA1和3'端引物5PA2、3PA2.经克隆分别得到了该基因的5'端和3'端基因片断,测序结果表明,其长度分别为461bp和636bp. 以克隆得到的5'端和3'端基因片断作为混合模板,以5PA1和3PA2为引物,应用SOE技术(splicingbyoverlapextension,又叫重叠延伸剪接术)嵌套得到了全长基因片断F1.测序结果表明,其长度为986bp,与GenBank上所登录的水解淀粉芽孢杆茵(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和牛链球菌(S.bovis)的β-1,3—1,4—葡聚糖酶基因具有较高的同源性,同源性分别达90%、98%、82%和85%.其CDS(Codingsequence,编码框)为729bp,可以编码242个氨基酸.同源性比较结果显示其所编码的氨基酸与上述四种微生物所编码的氨基酸之间存在相当大的保守区域.初步认定,这些保守区域可能与β-1,3—1,4—葡聚糖酶的功能有关.
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