Phytophthora和Pythium的许多种能向细胞外分泌一类小分子量的蛋白质,统称为elicitins.Elicitins在烟草上能引起过敏反应(hypersensitive response,HR)和系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR).Elicitins-烟草互作体系是研究信号识别、信号传导等诸多问题的良好体系.该论文报告作者对烟草寄生疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)中国菌株的elicitin基因进行克隆、表达及其诱导植物抗病性方面的研究结果.根据已报道的寄生疫霉par A1基因的序列设计引物,从4株寄生疫霉不同寄主分离物(3株来自烟草,1株来自刺槐)中克隆到此基因,序列分析表明4株寄生疫霉par A1基因序列高度保守,然后研究了par A1在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达.对表达载体pET30(+)双酶切(Nde I-BamH I),构建表达elicitin蛋白的表达载体pET-eli,用CaCl<,2>法转化大肠杆菌BL21菌株,通过IPTG诱导在大肠杆菌中产生的蛋白在烟草上引起过敏性坏死反应.对重组蛋白性质测定表明,重组蛋白有一定的耐热性,并对蛋白酶K敏感.至此,我们已成功地从寄生疫霉中国菌株中克隆到了par A1基因,并建立了大肠杆菌重组表达体系.在获得重组蛋白的基础上,测定了其诱导烟草和番茄对真菌、细菌和病毒病的抗病诱导作用.对不同浓度的elicitin进行诱导作用比较,此重组蛋白在30nM时,喷洒诱导烟草后产生最高的抗TMV的诱导作用;诱导作用可维持至少20天,其中在第4-5天诱导效果最好.因此,在elicitin诱导植物时,最好使用30nM浓度,并在诱导后第4-5天挑战接种可产生最大的诱导效果.用30nM的elicitin处理烟草和番茄,第4天接种测试的病原物,烟草经诱导后,烟草能抗TMV(tobacco mosaicvirus)、烟草黑胫病菌(P.parasitica)、烟草赤星病菌(Alternaria longipes)和烟草青枯病菌(Pseudomonas solanacearum),诱导作用分别是74.1%、63.8%、50.6%和45.0%;番茄经诱导处理后抗青枯病(P.solanacearum),诱导作用为43.1%.因此elicitin的抗病诱抗作用是非特异的.植物诱导抗性通常与过敏反应(HR)及病程相关(PR)等基因的表达相关联,而这些反应受信号分子水杨酸的调控,在不同体系中,还有H<,2>O<,2>等信号分子及Ca<'2+>通路因子的参与.为了明确elicitin诱导HR的上游信号传导因子,对elicitin处理后植株体内SA、H<,2>O<,2>的积累及Ca<'2+>通道相关反应作了测定.烟草经elicitin诱导处理后,体内水杨酸含量比对照提高了1.65-2.88倍,其中在诱导后的第1天和第4天各有一个峰值.用Ca<'2+>通道阻断剂La<'3+>与elicitin同时注射烟草叶片发现过敏基因HIN1表达被抑制,表明HIN1的表达依赖于胞外Ca<'2+>.在elicitin处理烟草后、过氧化氢酶(CAT)的活性下降1.15-1.62倍;相应地,elicitin处理的烟草植株体内H<,2>O<,2>迅速积累,但在测定的时间内没有出现"氧化迸发",H<,2>O<,2>含量只是在elicitin注射叶片后的第5和9小时各出现了两个小峰,并且H<,2>O<,2>的增加是系统性的,即不但处理叶片有量的积累,而且非处理叶片也有量的增加.根据这些现象,elicitin诱导HR的过程有SA、Ca<'2+>通道因子和活性氧的参与.为了明确上述信号分子的变化是否与HR相关,我们研究了elicitin诱导的细胞快速死亡及HR的分子表征.用elicitin注射烟草后0.5小时,HR的表征基因HIN1表达,在7小时内表达量逐渐变弱,而最终在12-16小时可观察到HR.HR的另外的表征分子苯丙氨酸裂解酶(PAL)和PR基因的表达.在烟草受elicitin处理后的6天内,PAL活性出现了2个峰,活性水平高出对照1.13-2.44倍.Elicitin喷洒诱导后.检测了防卫基因PR-1b的表达情况.PK-1b在诱导1天后就有表达而并在测定的5天内都有一定量的表达.用150nM的elicitin喷洒烟草叶片,经trypon-blue染色,在12小时可观察到有细胞坏死,说明elicitin引起了micro-HR,而水和低浓度的elicitin不能引起micro-HR;同时发现注射引起HR的elicitin浓度远比引起micro-HR的浓度低.证实能产生HR的激发子的诱导作用不见得要伴随micro-HR.
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