摘要
为探讨基因扩增的分子机制,寻找与肿瘤发生、发展及获得性抗药性形成相关的基因,本研究对人卵巢癌细胞UACC-1598及氨甲喋呤(MTX)抗性的小鼠胚胎成纤维细胞中DMs的大小、组成及其染色体起源进行了研究.应用染色体显微切割/DOP-PCR技术分离人卵巢癌细胞UACC-1598中的DMs,用微FISH技术鉴定DMs的染色体起源,发现该细胞中DMs起源于两个不同的染色体区域,即3q26和2p24.应用微克隆技术构建DMs特异性的DNA文库,结合顺序、Southern杂交和生物信息学手段鉴定扩增子的组成和大小,结果表明两个扩增子的长度分别为280 kb及388 kb,分别含有已知基因EIF5A2(3q26.2)和MYCN(2p24.3).已知EIF5A2基因在该细胞中过表达,RT-PCR分析表明NMYC基因也存在过表达.上述结果提示EIF5A2和MYCN基因的扩增和过表达在肿瘤的形成及演进中可能起重要作用.双色FISH分析进一步证实,两个非同线的扩增子定位于同一个DMs.应用CHEF及Southern印迹杂交技术分析DMs的大小,发现UACC-1598细胞中存在2.8Mb、2.1Mb及1.4Mb的DMs群体,提示多拷贝的扩增基因及其领近的染色体区域经染色体断裂、易位及重排形较大的DMs.同时,用浓度逐渐增高的MTX对小鼠胚胎成纤维细胞进行体外诱导,获得了具有不同抗性水平的MTX抗性细胞群体.细胞遗传学分析显示了MTX抗性细胞中存在大量DMs.应用Southern及Northern印迹杂交技术检测抗性细胞中基因的扩增和表达水平,结果表明,随着抗性的增强,细胞中DHFR基因扩增及表达水平也相应提高.应用CHEF和Southern印象杂交技术,在MTX抗性细胞中检测到2.5Mb及1.4Mb的DMs群体,且DMs的大小在不同抗性水平的细胞群体中没有明显变化,这些结果提示DMs中携带的DHFR基因直接介导了细胞抗药性的形成了,而且DMs形成后可稳定存在,在基因扩增过程中未发生进一步的演化.将分子细胞遗传学技术与各生物信息学技术相结合,利用日益完善的人类基因组数据库资源,将会极大地促进DMs的结构与功能研究,这不仅有利于相关扩增基因的快速鉴定,而且有助于深入探讨基因扩增的机制.DMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMsDMs
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