摘要
该论文针对南方红豆杉细胞紫杉醇的代谢调节从三方面开展了研究.一、细胞增长方面.红豆杉细胞生物量的积累是紫杉醇大量合成的前提.该文就影响红豆杉细胞增长的若干因素进行了研究,主要结论如下:1)植物生长调节物质对细胞的生长起重要作用.对75种激素处理的实验中证实NAA与6-BA的组合优于2,4-D与6-BA的组合,其中NAA l mg/L+6-BA 1 mg/L的处理可获得最大增长率达2.517;2)细胞继代前所处的时期也是影响细胞增长和紫杉醇积累的重要因素.研究发现在细胞生长的对数期继代较静止期继代的细胞增长率提高1.6倍,同时紫杉醇含量提高了近4倍;3)对红豆杉细胞营养吸收动力学研究表明,对数期继代的细胞吸收碳源、氮源早于静止期细胞,而两个处理的细胞对磷酸根和铵根的吸收则无明显差异.对数期继代有利于细胞生物量的积累和紫杉醇含量的提高.二、细胞培养紫杉醇代谢特点.该室在对红豆杉细胞次生代谢的研究中发现中间产物bacⅢ大量积累,约为紫杉醇含量的3倍.究其原因1)C-13侧链合成不足,2)紫杉醇骨架与侧链结合处酶一苯丙基转移酶(BAPT)表达量低.针对第一条原因进行了侧链前体添加实验但效果不明显,因此将工作重点转移到提高该酶表达量上来.三、BAPT超表达对紫杉醇代谢的影响.根据已报道的加拿大红豆杉苯丙基转移酶序列设计引物,通过RT-PCR克隆到南方红豆杉苯丙基转移酶cDNA的全序列,经序列分析该cDNA长度为1338bp,与已报道的该酶基因cDNA相比,其核苷酸和推测氨基酸同源率分别为97.76%和96.4%.构建了CaMV 35S启动子控制下的pBI-BAPT重组质粒,并通过农杆菌GV3101介导将目的基因转化到红豆杉悬浮细胞中.通过GUS活性检测、PCR、PCR-Southern及Southern检测表明外源基因已整合到基因组DNA.我们还构建了原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达了BAPT的融合蛋白,通过蛋白电泳分离目的蛋白并制备了相应抗体,抗体效价为1:102400.利用制备的抗体进行了转基因细胞的Western-blot,分析表明,转BAPT细胞的抗原抗体反应信号较未转基因的强,转基因红豆杉细胞中BAPT超表达成功.HPLC检测结果显示,转BAPT基因红豆杉细胞bacⅢ含量较未转基因的降低60%,紫杉醇含量是未转基因的3倍达0.309mg/g DW.该文首次报道了利用根癌农杆菌介导对红豆杉悬浮细胞进行目的基因转化,提高酶表达量从而提高紫杉醇含量.对红豆杉悬浮细胞进行目的基因转化开创了这一重要药用植物基因工程方面的新思路.
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