摘要
为了阐明WNK4基因与原发性高血压的关系及其在原发性高血压发病机制中的作用,该研究在中国东北汉族高血压高发地区对WNK4基因位于编码区内的两个SNP进行了大样本RFLP筛查.同时对WNK4基因的表达调控机制及其与原发性高血压的关系进行初步研究.结果1.小样本测序检测到WNK4基因exon7一个新SNP(G1662A),大样本RFLP筛查证实该SNP和另一个位于exon8的cSNP(G1816T)的等位基因频率在高血压及正常人群间存在显著性差异,但基因型频率无显著性差异.两者与我国东北汉族高血压发病存在密切相关.同时通过对不同种族人群的对比分析发现我国东北汉族人群WNK4基因exon8 G1816T多态的基因型频率和等位基因频率与高加索人、非洲人比较差异明显,具有统计学意义(p<0.001),但与美国黑人相近,没有显著性差异(p>0.05).2.WNK4基因表达谱分析结果显示WNK4基因在胎儿肾脏有高强度表达,在脑、肺、心、脾、肠等组织中有表达,但在肝组织中却无表达.3.以重组人生长激素(hGH,终浓度为6nmol/L)、重组人雌激素(β-E2,终浓度为1 μmol/L)、血管紧张素Ⅱ(AngII,终浓度为5μmol/L)、地塞米松(Dexamethson,终浓度为1nmol/L)及重组人胰岛素(Insulin,l00nmol/L)处理COS-7细胞24小时,RT-PCR及Northern杂交检测结果均显示与空白对照组比较WNK4基因mRNA表达均有不同程度减少.4.经5′RACE反应得到一490bp片段,产物稀释50倍,取5ul作为模板接着进行5′-巢式RACE,电泳结果可见约210bp的片段.经过与网上WNK4基因序列对比,发现两个片断大小均一致反应了同一转录起始位点,初步确定WNK4基因转录起始点位置.5.EMSA结果可见到两条与SP1、AP1特异结合的核蛋白电泳结合带,且该结合带可被未标记同位素的40倍的SA所拮抗,说明该序列存在SP1、AP1等转录因子特异结合序列,为WNK4基因的启动子序列.6.ELISA检测CAT活性发现不同浓度的地塞米松均使WNK4基因mRNA表达水平下调,同时我们发现低浓度地塞米松使WNK4基因mRNA表达水平下调程度明显强于高浓度地塞米松.地塞米松对WNK4基因mRNA表达具有负调节作用,且具有剂量依赖性.因此我们推测地塞米松等糖皮质激素可能通过调控GR与WNK4基因5′侧翼序列GRE特异结合,对WNK4基因转录发挥了负向调节作用.
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