摘要
该研究以人溶菌酶(hLY)基因为材料,构建了其原核表达载体并在IPTG诱导下成功表达;构建了以gfp为报告基因的植物核表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘法转化生菜(Lactuca sativa L.),获得转基因植株,主要研究结果如下:1.构建了原核表达载体pET28a-lyz.通过内切酶NdeI/EcoRI酶切hLY基因的克隆载体质粒pBS-lyz,获得hLY基因,亚克隆至原核表达载体pET28a,获得hLY基因的原核表达载体,在1mMIPTG浓度下诱导表达了约14.7kD的目的蛋白溶菌酶.2、构建了hLY基因的植物核表达载体pBG-lyz-gfp.通过NdeI与EcoRI双酶切PBG质粒和pET-28a,回收后将PBG质粒大片段部分与大约500bp hLY基因片段相连,产生过渡质粒pBG-lyz,扩增得到GFP基因后,EcoRI与SalI双酶切,回收750bp的GFP基因片段,与同样经EcoRI与SalI酶切的pBG-lyz的载体大片段相连,经PCR验证后表明得到hLY基因的植物核表达载体pBG-lyz-gfp.3、建立和完善了生菜再生体系.通过不同抗生素浓度对子叶外植体再生的影响的实验表明,适宜的Km选择压为100mg/L,Carb的浓度为300mg/L,在此基础上建立了完善的生菜再生体系.4、获得转hLY基因的生菜Km抗性株.通过农杆菌介导的叶盘法,将hLY基因转入生菜,经在含100mg/LKm的诱芽培养基和生根培养基筛选,获得Km抗性株.5、鉴定生菜Km抗性株为转基因植株.对Km抗性株嫩芽在蓝光激发下的GFP观察和以其DNA为模板的hLY PCR扩增鉴定,证明获得了转hLY基因的生菜.
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