摘要
以精子作为载体的研究目前还主要集中在与重要代谢有关的少数基因上,并未真正的体现出该技术的优越性,该研究选用同物种的精子作为载体介导进行SRY的转基因研究,探讨与动物生产有关的性别控制的新途径,目前还未见相关文献报道.该实验从小鼠血液中提取基因组DNA后,设计引物进行PCR扩增获得的目的片段Sry与克隆载体pMD18-T连接后进行测序,与Genbank查得的Sry序列进行对照确定为目的基因后,EcoR Ⅰ/Not Ⅰ双酶切下目的片段与真核生物表达载体pCR3.1相连,得到重组质粒pCR3.1-Sry.在转基因前,为了验证精子是否携带目的基因以及吸附部位,设计特异性探针对不同处理状态的精子进行荧光原位杂交(FISH).DNA水平杂交结果直观地表明未经任何处理的精子,大概有50%具有阳性性号,都位于核质周边区;在未经洗涤的精子介导的Sry的阳性性号位于核质外在靠近尾部及其头周边的区域里,很少有进入核质的;而经过洗涤后直接介导Sry基因的精子则大部分都有阳性性号说明Sry进入核质包埋或整合到染色质中,而且加入脂质体协助介导Sry杂交显示阳性率更高,说明洗涤和脂质体有助于Sry基因进入核质并整合到染色质中,为此技术提供了直接的证据.这一结果不仅可以帮助人们进一步明确认识精子中本来存在的Sry以及介导的Sry在精子细胞中确切位置,而且还将会对于人们进一步认识和理解Sry的作用机制有着重要的理论意义.为弥补精子体外操作所带来的受孕率降低,在动物人工授精实验中使用PMSG/HCG促小鼠超排卵,为了提高转基因效率,该研究参照文献报道使用多种方法处理精子,比较各种处理及其组合的转基因效果差异.因此该实验首次使用精子介导Sry转基因技术实现了XX基因型小鼠的性反转操作,证实了Sry转基因可以有效的导致胚胎向雄性方向发育的有效途径,由于精子介导的转基因技术具有上述诸多优点,该文为精子介导的Sry基因调控研究开启了广阔的前景,为在分子生物学水平进一步研究雄性生物学,发育生物学提供了重要的研究平台,同时,也为性别控制的动物学生产实践奠定了坚实的基础,当然有关技术细节还有待于进一步优化,对转基因的稳定性还需要进一步验证.
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