摘要
该文选用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)为实验材料,研究了不同时期CHS的表达情况,发现甜菜夜蛾几丁质合成酶是阶段性表达的,如五龄初、预蛹末期和蛹初期都有表达,特别在成蛹的时候表达量最高,而在龄期之间不表达.说明甜菜夜蛾几丁质合成酶基因SeCHS1-1c参与了幼虫的表皮、口器和蛹期的围食膜(peritrophic membrane,PM)的形成.同时利用同一对简并引物分别从基因组DNA和cDNA中扩增出725bp和528bp的片段,经分析DNA片段中含有2个内含子,它们与其他昆虫CHS基因高度同源,属于几丁质合成酶的催化域区域.在获得该片段的基础上,我们设计了两个特异性引物,利用RACE技术获得了2.5kb和1.5kb的两个片段,拼接后长3843bp,它的ORF长为2760 bp,编码一个919个氨基酸的蛋白.SeCHS1与烟草天蛾(M.sexta)MsCHS1的同源性最高,达到91%,是一个跨膜蛋白,N端共有9个跨膜螺旋区域,无信号肽和信号锚,可能不能分泌蛋白.由于缺失了C端的跨膜区和3'端的不保守性,可以推断该片段的3'端不完整.在此基础上,重新设计了3'-RACE引物,获得了2kb左右的二次3'-RACE PCR产物.在获得甜菜夜蛾几丁质合成酶部分序列片段的基础上,将SeCHS1-1g转化至大肠杆菌表达型宿主BL21(DE3)中进行原核表达.转化的结果很好,测序鉴定表明,插入序列长度为725bp,和原始序列的比较结果同源性达到99.5%,只有在277位G→A突变.转化到表达宿主菌的酶切鉴定表明片段获得了正确的插入.但是蛋白电泳没有出现想要的结果,可能与插入片段的不完整性、几丁质合成酶的不稳定性或者其他一些原因有关.
NETL