摘要
背景、目的该课题,通过研究哮喘豚鼠在火把花根片和地塞米松治疗后BALF中的细胞总数与细胞分类、肺组织病理学HE染色、IL-5免疫组化以及BALF中自介素-3-α-受体mRNA(IL-3Rα mRNA)和白介素-5-α-受体mRNA(IL-5Rα mRNA)的表达情况,同时比较两种药物对哮喘豚鼠的作用.我们总结出火把花根片对哮喘豚鼠气道的部分抗炎机制,为这个传统中药对哮喘的临床应用提供了初步的实验基础.材料与方法(一)豚鼠哮喘模型的制备及分组.32只健康杂色豚鼠随机分为4组:哮喘组,地塞米松治疗组,火把花根片治疗组和正常对照组.每组8只.先将其中三组用10%的卵蛋白(OVA)生理盐水混悬液1ml腹腔注射.第15天将1%OVA溶液用超声雾化激发,直至豚鼠出现呼吸急促,点头运动及腹肌明显收缩时停止.制备成豚鼠哮喘模型后,把其中一组当作哮喘组,其他两组分别用地塞米松、火把花根片治疗2周.最后一组为正常对照组.(二)BALF的收集及细胞计数与分类.麻醉豚鼠,用3mlHanks液灌入支气管肺组织内,回收BALF,共灌洗3~4次.将BALF离心后,取少量于载玻片上涂片染色,进行细胞总数和细胞分类.(三)肺组织病理切片和IL-5的免疫组化.在每次肺泡灌洗后,切取豚鼠右侧肺,用10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋、切片,HE染色,脱水、透明、封片.光镜下观察Eos的浸润及上皮细胞脱落等病理学改变.拍片.另一部分石蜡包埋切片按下述步骤染色:载玻片防脱片剂处理;切片常规脱蜡至水;蒸馏水新鲜配置3%H2O2,室温5-10分钟以灭活内源性酶;热修复抗原;滴加正常山羊血清封闭液;滴加1:150稀释的一抗,37℃ 1小时左右,4℃过夜,0.1M PBS洗2分钟,共3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG,20-37℃ 20分钟,0.1M PBS洗2分钟,共3次;滴加试剂SABC,20-37℃20分钟,0.1M PBS洗5分钟,共4次;DAB显色;苏木素轻度复染;显微镜下观察,细胞浆内出现棕黄色产物为阳性反应;拍片.(四)IL-3Rα引物,IL-5Rα引物和β-actin引物的合成扩增鼠IL-3Rα引物,IL-5Rα引物及β-actin引物参照McClanahan等文献设计,由上海博亚生物技术公司合成.其中β±actin作为内参.(五)RT-PCR及半定量分析RNA提取及逆转录:用RT-PCR试剂盒提取.从液氮中取出每组样品标本.RNA提取及逆转录方法参照试剂盒说明书进行.两次PCR扩增后产物检测:取8μl PCR产物,用2%琼脂糖凝胶电泳,以β±actin为阳性对照,用UVItec凝胶分析仪将电泳图扫描后进行分析.以积分光密度IOD(目的带)/IOD(β-actin)之比进行半定量分析.(六)统计学处理各组结果以Mean±SD表示,所有数据均用SPSS10.0软件单向方差分析(One-WayANOVA)统计分析.各组间比较采用SNK法或Dunnetts法.P<0.05表示有统计学差异.结论火把花根片对哮喘豚鼠气道的抗炎机制及意义:(一)火把花根片能显著的抑制哮喘豚鼠气道以Eos为主的炎症细胞的浸润.(二)火把花根片能有效的降低哮喘豚鼠肺组织毛细血管通透性,减轻组织水肿等抑制病理性免疫作用.(三)火把花根片能上调细胞因子受体,显著地增加IL-3Rα mRNA、IL-5Rα mRNA的表达.(四)火把花根片能抑制IL-3、IL-5的表达,进而抑制哮喘豚鼠气道内Eos的聚集、浸润与活化,发挥其拮抗气道变应性炎症的作用.(五)火把花根片与地塞米松对哮喘豚鼠的部分抗炎机制相似,且其毒副作用不明显,火把花根片可能是地塞米松潜在的比较好的替代药物.
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