摘要
该实验从临床经验方DXR中选取丹参作为研究对象,并借鉴炎症信号转导研究的进展,推测丹参酮可以拮抗LPS加强NF-κB活性的作用,从而可以抑制炎症细胞在动脉管壁集聚,抑制动脉粥样硬化斑块形成.旨在了解Tan对LPS增强NF-κB表达活性,并导致炎性细胞因子大量释放的作用,从信号转导的角度阐明Tan拮抗LPS致炎作用的可能机制;为DXR拮抗LPS,防治动脉粥样硬化的临床应用提供理论和实验依据;并为中医药复方研究提供新的思路,为中药在分子水平上的作用寻找新的药物靶标.二、方法采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将含NF-κB的质粒pNF-κB-TA-Luc和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染人胚胎肾细胞HEK-293细胞,用细菌脂多糖(LPS)、丹参酮(Tan)刺激转染后的HEK-293细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS和Tan对NF-κB活性的影响;以基因重组技术构建含全长TLR4重组腺病毒Ad-TLR4和含细胞内段缺失的TLR4重组腺病毒Ad-△TLR4;采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将含NF-κB的质粒pNF-κB-TA-Luc和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染CHO-K1细胞,并加用重组腺病毒感染,给以细菌脂多糖(LPS)、丹参酮(Tan)刺激,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS-TLR4通路在NF-κB激活中的作用;利用改进后的T7噬菌体展示筛选系统对TLR4相互作用蛋白进行初步的筛选.四、结论1、正确构建了含TLR4全长和细胞外段的重组腺病毒,并在CHO-K<,1>细胞得到良好的表达.2、利用报告基因技术显示了LPS对细胞内NF-κB活性的增强作用,并发现Tan对这一增强作用有明显的抑制效应.3、利用重组腺病毒技术验证了LPS对NF-κB的活性增强作用主要是通过TLR4受体通路实现的,并发现了Tan对LPS的调节作用也是通过这一通路实现的.4、从分子水平阐明了Tan抑制LPS效应的作用机制,为DXR防治动脉粥样硬化的临床应用提供了理论和实验依据5、为中医药复方研究提供了新的思路,为中药在基因水平上的作用找到了新的药物标靶.6、为进一步探明TLR4对LPS识别通路的作用机理,我们扩展了T7噬菌体展示筛选系统的应用范围,首次在活体细胞上应用该技术对TLR4的结合蛋白进行了筛选,为下一步的实验打下了基础.
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