摘要
该研究在探索银耳遗传转化体系的基础上,构建了高赖氨酸蛋白基因表达载体,利用限制性内切酶介导整合法(REMI),首次把高赖氨酸蛋白基因导入银耳芽孢,获得了转基因菌株.对转基因菌株进行分子检测,证实了外源基因已整合到银耳基因组中.氨基酸含量测定表明,转基因银耳中赖氨酸含量得到不同程度的提高.具体结果如下:1.银耳原生质体制备与再生条件优化.以芽孢、菌丝体和子实体为材料,通过正交实验,考察了菌株、酶浓度、酶解时间以及酶解温度对原生质体产率和再生率的影响,结果显示:实验材料对原生质体产量影响最大,以芽孢为材料原生质体产量可达到2.75×10<'7>个/ml,而菌丝体和子实体的原生质体产量仅为2.5×10<'6>个/ml和1.0×10<'6>个/ml;在35℃下酶解,原生质体产量最高;溶壁酶浓度在1%~3%之间对原生质体产量影响不大;不同菌株原生质体产量差异不显著.该实验还研究了稳渗剂浓度对原生质体再生率的影响,结果表明,0.5 mol/L~0.7mol/L的KCl对原生质体再生没有显著差异,再生率最高为32.3%.2.营养缺陷型菌株的筛选.对比紫外线与γ射线对银耳芽孢的诱变效应,γ射线诱变获得了48个缺陷型菌株,经传代后都被修复,没有获得稳定的突变体,紫外线诱变后有62个缺陷型菌株,经过传代后获得2株稳定的缺陷型突变体,获得两个营养缺陷型菌株,其中一株Tau811经鉴定是肌醇缺陷型.突变体Tau811的生长迟缓期比野生型多3天,生长速度较慢.3.高赖氨酸蛋白基因转化银耳及分子检测.以pBR-lys为中间载体,把pBR-lys的Pubi启动子置换成P35S,构建成表达载体pCB-lys.应用REMI介导转化银耳芽孢,获得众多的转化子,核rDNA检测结果和营养缺陷型检验结果表明,这些转化子均是银耳芽孢.PCR检测结果:转化子携带P35S启动子、Lys基因、GUS基因、hpt基因、Tnos终止子.转基因银耳芽孢对潮霉素的抗性水平可达到150ug/ml以上,大部分转化子检测到GUS活性.4.转基因菌株赖氨酸含量测定.利用氨基酸自动分析仪,对潮霉素抗性较强的6个转基因菌株以及对照Tau811进行氨基酸分析,结果显示:转基因菌株的赖氨酸含量都有不同程度的提高,其中有4株提高了11%以上,最高一株为16.57%,而且蛋白质中氨基酸总量也有较大幅度的提高.
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