摘要
熊果酸(ursolic acid,UA)是熊果、白花蛇舌草等天然药物中的三萜酸活性成分,具有多种生物学活性.我们初步研究了熊果酸对人红白血病K562细胞的作用及其机制.熊果酸实验用浓度范围0μmol/L~50 μmol/L,监测时间点为熊果酸作用后24h、48h、60h.采用MTT法和流式细胞术检测熊果酸对K562细胞的增殖抑制效应,并得到不同熊果酸实验浓度对K562细胞的增殖抑制率,用单细胞凝胶电泳分析熊果酸对K562细胞DNA的损伤,Hoechst33258荧光染色观察DNA片段化的凋亡征象,细胞免疫化学染色检测Bcl-2和Bax的表达,Western-blotting检测K562细胞内Caspase-3和p<'210>磷酸化酪氨酸(BCR/ABL融和蛋白)的表达和活性.MTT结果表明熊果酸在终浓度超过30μmol/L时对K562细胞具有中等强度的增殖抑制效应,并呈浓度和时间依赖性.流式细胞术检测结果表明40 μmol/L熊果酸作用后K562细胞的S期降低,并出现明显的G2/M期阻滞:对照组、熊果酸作用24h组和48h组的G2/M期细胞比例分别为11.0%、40.5%和48.1%.单细胞凝胶电泳显示经熊果酸作用的K562细胞出现明显的慧尾状DNA漏逸.Hoechst33258荧光染色显示K562细胞核体积变小、皱缩,可见致密荧光,染色体DNA呈浓染的团块状、颗粒状分布.细胞免疫化学染色结果显示50 μmol/L熊果酸作用24h、48h、60h后,Bax蛋白的光密度增强.Western印迹法检测50μmol/L UA作用6h、12h、18h、24h后,与对照组相比,32KDa处Caspase-3酶原的表达减少,而17KDa处Caspase-3活性片段的表达增加,并呈时间依赖性;与对照组相比,UA作用后210KDa处磷酸化酪氨酸的表达依次降低,其它位置磷酸化酪氨酸的表达也有所降低.熊果酸对K562细胞具有一定的增殖抑制和杀伤作用,并具有浓度依赖性和作用时间依赖性.熊果酸可能主要作用于G2/M期的K562细胞,通过对细胞DNA的损伤阻止K562细胞增殖.熊果酸上调K562细胞内Bax的表达,故熊果酸能够增强K562细胞对凋亡诱导因素的敏感性.熊果酸作用下K562细胞内Caspase-3酶原活化并呈时间依赖性,表明熊果酸对K562细胞作用的机制部分是通过诱导细胞凋亡实现的.熊果酸亦能够抑制K562内210KDa处磷酸化酪氨酸的表达,且呈时间依赖性,提示K562细胞特征性BCR/ABL融合蛋白的表达或其酪氨酸激酶活性很可能被UA抑制,从而使K562细胞的增殖和存活受到干扰.
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