摘要
该研究以牛和山羊胎儿为材料,从原始生殖细胞分离培养出EG细胞,并进行传代培养和鉴定,对影响胚胎生殖细胞(Embryonic germ cell,EG)分离与培养的影响因素进行了探讨,为进一步建立牛和山羊EG细胞系奠定了基础.实验主要结果如下:(1)从49例牛胎儿分离培养胎儿原始生殖细胞(Primordial germ cell,PGC),胎龄在29~50d的牛胎儿可以用于分离培养原始生殖细胞,最高传至7代.(2)统计46例山羊胎儿分离培养原始生殖细胞情况,胎龄在25~38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做EG细胞的分离培养,最高传至6代.(3)用不同的饲养层培养牛原始生殖细胞,实验结果表明MEF,STO和BEF饲养层都能支持牛原代PGCs的增殖,但MEF较BEF和STO效果更好(4)以MEF、GEF、BEF为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞.传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组二者差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P<0.05).(5)以共培养方式培养牛、山羊原始生殖细胞,在原代培养时,都可以出现大量形态较好的EG细胞集落,说明同源的体细胞可以很好的支持PGC的生长和增殖.(6)试验以三个不同浓度LIF的培养液培养山羊PGCs.在原代培养时,效果差异不显著(P>0.05);而在传代过程中,以含LIF 10 ng/mL组培养效果最好,但与含LIF5 ng/mL组差异不显著(P>0.05),LIF 1 ng/mL组培养效果较差(P<0.05).(7)试验比较了不同消化方法对山羊胎儿原始生殖细胞分离的影响.在37℃下,0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA(处理20~30 min)消化分离效果较好于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA(处理15 min)(8)试验比较了不同传代方法对牛和山羊胚胎生殖细胞细胞传代的影响,发现消化+机械分离法和消化+吹打法都可以用于EG细胞的传代.消化+吹打法操作简单,省时省力,也能够很好的保持细胞的增殖活力.(9)牛和山羊的胚胎生殖细胞集落碱性磷酸酶鉴定为阳性.牛原代胚胎生殖细胞进行了细胞表面标志抗原SSEA-1,3,4鉴定,呈弱阳性.细胞体外培养可以分化为脂肪细胞、成纤维样细胞、上皮样细胞和类胚体.
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