摘要
该论文以一株编号为2B的苦皮藤内生真菌为出发菌株,应用形态学的方法鉴定了其种属地位;研究了其代谢产物的农用生物活性,并对目标活性物质进行分离和结构解析,采取诱变育种手段选育了高产菌株,并对高产菌株的发酵条件进行了优化.通过试验结果的分析和讨论,取得了以下结论:1、根据真菌的分类及鉴定方法,用光学显微镜观察2B菌株气生菌丝、大型分生孢子、小型分生孢子及菌落性状,对比相关分类系统,将2B菌株鉴定为层出镰刀菌(Fusarium proliferatum).2、在对2B菌株发酵产物生物活性研究中,发现2B菌株发酵产物甲醇提取物有明显的抑菌活性,在1000μg·mL<'-1>浓度下对番茄早疫病菌(Alternaria solani)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)4种供试菌的菌丝生长和孢子萌发抑制率均大于80%;在盆栽试验中,对黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)的治疗和保护作用均在70%以上.3、采用常压柱层析、HPLC制备等方法,在生物活性追踪指引下,从2B菌株发酵产物分离出4个化合物2B-1,2B-2,2B-3,2B-4.经波谱技术(IR,<'1>H NMR,<'13>C NMR,COSY,MS),结合化学检验方法,并与相关文献对比,将分离得到的化合物分别鉴定为enniatin B,enniatin B<,1>,enniatin A<,1>,ergosterin.化合物2B-1,2B-2,2B-3在100μg·mL<'-1>浓度下,对玉米大斑病原菌菌丝生长抑制率分别为68.18%,87.49%,90.91%.4、建立了恩镰孢菌素(enniatins)的HPLC检测方法.检测条件为色谱柱(C18柱,0.9×30cm,10μm);流动相(V:V)甲醇:水(88:12);流速1mL·min<'-1>;检测波长UV229nm;室温下5μL进样,该方法相对标准偏差RSD<1%,平均回收率在98%以上.5采用紫外线(UV),甲基磺酸乙酯(EMS),超声波+UV+EMS 3种诱变方式进行复合诱变,同时结合形态变异与产量之间的相关关系,挑选形态差异明显的单菌落,然后通过摇瓶发酵筛选enniatins高产菌株,通过3轮诱变筛选大幅度提高了菌种的生产能力,最后得到的突变株UE152代谢enniatinns总产量为59.72mg·100mL<'-1>,是出发菌株摇瓶效价2.9倍,且该突变株的高产遗传特性稳定.6、通过单因子试验和多因子正交试验筛选获得UE152菌株最佳的摇瓶培养基配方和发酵条件为葡萄糖2%、土豆20%、蛋白胨0.5%、NH<,4>Cl0.3%、MgS0<,4>0.1%和CaCO<,3>0.1%,培养温度26℃,接种量10块菌饼(每50mL发酵液),初始pH值为6.0~7.0,装液量50mL(每250mL三角瓶),转速160rpm,发酵时间120h.在上述实验条件下enniatinns总产量可达88.68mg·100mL<'-1>,从正交试验结果分析当中看出,如果适当增加通气量,产量可望更高.
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