摘要
该研究的目的,是设计和构建真核表达结核菌蛋白的载体即DNA疫苗,并对其免疫功能及保护力进行研究.所构建的12种质粒DNA,经PCR、酶谱鉴定后,并对插入表达目的的DNA片段进行了测序分析,表明所构建的12种载体质粒与构建设计准确无误.TB-V6~TB-V10等5种疫苗免疫的5只小鼠的脾结核菌载量分别为44168、28400、18597、34703和22954CFU/g.TB-V6+p-hIL2和TB-V7+p-hIL2联合免疫组和p-hIL2注射组的脾结核菌载量分别为12471、34157和51339 CFU/g.对照组PBS、pVAX1、p-hIL2s及BCG的脾细胞悬液的结核菌计数结果均数分别是:61012、60716、69395和11164CFU/g.表明该研究中构建的TB-V6~TB-V10等疫苗具有减少免疫鼠经H37Rv攻击后脾脏结核菌载量,且TB-V8疫苗,TB-V6+p-hIL2联合免疫,产生的保护力与BCG免疫产生的保护力非常接近.为进一步研究这些疫苗防止大动物感染结核菌H37Rv的实验研究奠定了基础.我们在结核DNA疫苗的构建设计中使用了hIL-2信号肽序列,并采用表达hIL-2的质粒与TB DNA疫苗联合免疫及构建表达融合蛋白(GST)的疫苗,并获得与BCG非常接近的保护力.均为TB DNA疫苗研究首次报道.取得了预期的研究结果,对其他疫苗的研究有指导参考价值.结论:1.所构建的表达结核菌蛋白或融合蛋白的载体:TB-V1、TB-V2、TB-V3、TB-V4、TB-V5、TB-V6、TB-V7、TB-V8、TB-V9、TB-V10、表达hIL-2的载体p-hIL2和表达hIL-2信号肽的载体p-IL2s等经抗性筛选、酶谱鉴定及DNA序列分析,结果表明12种DNA疫苗表达载体质粒的构建均与设计要求准确无误.2.TB-V6、TB-V7、TB-V7、TB-V8、TB-V9与TB-V10 5种DNA疫苗单独免疫,或者与p-hIL2联合免疫,免疫C57B6/6小鼠的脾淋巴细胞培养上清均能检测达到高水平的mIFN-γ和mIL-2,而mIL-10的含量则较低,注射过p-hIL2载体的小鼠的血清中,hIL-2含量高.表明TB-V6~TB-V10可以在小鼠模型体内表达,并诱导Th1型免疫应答.3.经TB-V6~TB-V10等5种的DNA疫苗免疫后,鼠脾的细菌载量较对照组(PBS、pVAX1、p-IL2s)降低.说明该5种疫苗及构建的p-hIL2载体的免疫,给动物模型提供一定的保护力.4.经TB-V8疫苗100μg免疫以及p-hIL2质粒与TB DNA疫苗TB-V6各50μg免疫,使免疫小鼠的脾脏结核菌载量与BCG免疫组的载量非常接近,表明该2种疫苗免疫产生的保护力与BCG的保护力相当,具有非常好的研发前景.
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