摘要
从海带雌、雄配子体细胞中分别提取总RNA,分离纯化poly A+mRNA,反转录后,利用抑制消减杂交方法同时进行正、反向消减杂交.该方法主要通过两轮消减杂交和巢式PCR扩增,富集海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,然后将获得的雄配子体特异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中,构建雄配子体特异表达的cDNA消减文库.经蓝、白斑筛选,共得到750个白色克隆,随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳分析表明插入片段大小在200~1000 bp之间.正向和反向消减cDNA的PCR产物先后以RsaI、SmaI、EaeI酶切处理,用Dig-Chem-Link试剂盒(Roche)标记后作为探针,对随机挑选的100个克隆通过二轮斑点杂交筛选去除假阳性.最后随机挑选10个阳性克隆测序,利用GenBank数据库进行同源性搜索,结果表明有7个片段与已知基因序列无同源性,其中两个为相同的片段,初步判断这7个片段为新的基因序列;有3个片段与已知基因部分序列有较高的同源性,其中BA079-1及D11片段都与墨角藻黄素叶绿素a/c结合蛋白的部分序列同源性达88%,BA079-10与捕光色素蛋白lhcf6(lhcf6)的同源性高达98%.BA079-1及D11片段经Northern杂交检测进一步证实了在雌、雄配子体中存在表达量的差异.
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